Nature子刊:连续诱导重编程系统揭示干细胞特异基因突变

虽然利用诱导多功能干细胞技术可以培育有生育能力的成年小鼠,但直到现在仍未确定累积的突变对培育的诱导多功能细胞发育潜能的影响。由北京生命科学研究所的高绍荣(Shaorong Gao)研究员、中国农业大学的田见晖(Jianhui Tian)教授以及中科院北京基因研究所的蔡军(Jun Cai)研究员领导的合作团队通过研究建立干细胞(iPSCiPSC连续诱导重编程系统并结合二代测序和生物信息分析确立了基因突变对iPSC发育潜能的影响。该成果发表在20152月《Nature Communications》杂志上。

世代数增加但成活率下降

研究人员利用一种Tet-on可诱导重编程系统技术证实,通过四倍体囊胚补偿的诱导多能干细胞技术培育小鼠能够耐受多达六代累积的体细胞突变。研究表明,利用Tet-on诱导胚胎干细胞系统可以培育具有正常生育能力的纯诱导多功能干细胞培育成年小鼠。

小鼠六代培养示意图

为了进一步验证具有正常生育能力的纯诱导多功能干细胞培育小鼠能否繁殖许多世代,应用四倍体囊胚补偿技术,研究人员连续成功培养了第四、五、六代纯诱导多功能干细胞培育小鼠,从第四、五、六代纯诱导多功能干细胞培育小鼠中获取体细胞,将体细胞诱导恢复到多功能干细胞状态,然后建立了第四、五、六代诱导多功能干细胞系。总体来说,经过碱性磷酸酶染色反应鉴定表明连续重编程技术的诱导效率大约是0.7%,纯诱导多功能干细胞培育小鼠的成活率约为1.4%,与最近研究报道的结果类似。但是,纯诱导多功能干细胞培育小鼠的生存能力随着世代数的增加迅速降低。例如,第一代到第三代纯诱导多功能干细胞培育小鼠能够生长成有生育能力的成年小鼠,而第四代和第五代纯诱导多功能干细胞培育小鼠都仅能生存4周零2天。更明显的是,第六代纯诱导多功能干细胞培育小鼠共有27只,在进行剖腹产以后全部立刻死亡。

研究人员对连续重编程培育的诱导多功能干细胞系利用MeDIP-seqRNA-seq技术进行5-甲基胞嘧啶分析。结果显示这些细胞系仅仅在基因启动子区域积累了极少量的甲基化差异。但是,连续重编程产生的诱导多功能干细胞下游基因表达水平提示在基因启动子区域积累的甲基化差异不对基因的表达起顺式调节作用。而且发现核心组蛋白修饰,例如H3K4me2H3K4me3H3K27me3,在诱导多功能干细胞系能否培育成纯诱导多功能干细胞培育小鼠过程中起着一定作用。可见,纯诱导多功能干细胞培育小鼠可以连续培养六个世代,随着世代数的增加小鼠的存活率下降,表观遗传学的影响可能不是导致小鼠存活率下降的主要原因。

连续重编程过程中单核苷酸变异(SNVs)不断累积

为了进一步探究是否是连续重编程影响了基因的完整性,从而影响了纯诱导多功能干细胞培育小鼠的生存能力,研究人员对连续重编程培育的诱导多功能干细胞进行全基因组测序以测定遗传信息改变的潜在影响。

对样本进行测序并对比结果后,发现在连续诱导多功能干细胞过程中有成千上万个SNVs在基因组中积累。在实验中,研究人员确认了59SNVs(包括44种非同义SNVs)。其中,16种已在老鼠基因组信息学数据库列为纯合致死型突变。另有研究表明,有7种突变在连续重编程晚期积累为杂合子表型。特别是第三代诱导多功能胚胎干细胞的Ep300基因和其后第五代诱导多功能胚胎干细胞的Ryr2基因同时发生了一个等位基因突变,进而引发与心脏发育缺陷相关的单倍剂量不足的表型。Cd2ap基因单倍剂量不足的小鼠表型与人类的局灶性节段性肾小球硬化类似。对第六代纯诱导多功能干细胞培育小鼠组织进行组织病理学检查,发现其心脏和肾脏出现异常形态。在Ep300Ryr2Cd2ap基因上错义突变的共同作用逐渐扰乱了机体可容忍的遗传负荷,导致多次诱导后培育的子代纯诱导多功能干细胞培育小鼠的培育失败。

SNVs分析图

在多功能干细胞中发现重复序列的拷贝数变异(CNAs

SNVs不同,在连续重编程过程中重复序列的CNAs没有明显的积累现象。相反,根据连续重编程小鼠基因组数据显示,在每个连续诱导多功能干细胞系都存在几个相同的重复序列的CNAs,但是这些重复序列的CNAs在培育成功的纯诱导多功能干细胞小鼠的体细胞中检测不到。研究人员排除了由于复制时间导致的假的重复序列的CNAs。深入分析发现,这些重复序列的CNAs不仅在连续诱导多功能干细胞系中存在,也存在于核移植诱导的胚胎干细胞系、正常受精得到的胚胎干细胞系以及另一个实验室诱导的胚胎干细胞系。通过单细胞PCR分析,研究人员进一步证明这些CNAs仅在一部分多功能干细胞中存在,包括胚胎干细胞、核移植诱导的胚胎干细胞和诱导多功能干细胞。多功能细胞在重复序列的CNAs上具有异质性。

CNAs重复拷贝

研究人员还从第二代诱导多功能干细胞系中随机挑选8个多能干细胞,每个细胞分别培育成亚克隆的多功能细胞系。在第二代诱导多功能干细胞系中缺失了等位基因的细胞所占的比例大概是50%,根据二项式分布的概率函数有99%的可能在这8个诱导多功能干细胞中至少有一个细胞携带缺失突变,另一个细胞中没有缺失突变。令人惊奇的是,利用单细胞PCR分析技术发现每个亚克隆的多功能干细胞系都是由携带缺失突变的细胞和没有缺失突变的细胞混合而成。这个补充实验说明,不管初始的单细胞的性质,遗传的异质性是多能干细胞的一个基本特征。补充的分化实验证明,CNAs倾向于出现在一些多能干细胞系中,然后在后续的细胞分化过程中消失。这个模式与细胞的培养传代没有关系,因为CNAs在诱导多功能干细胞系传代过程中被保留,而在其它已分化细胞系延长细胞培养传代过程中不出现。实验证实这些CNAs在胚囊中可以检测到,而在具有相同遗传背景(例如诱导多功能干细胞)的成年小鼠的新鲜组织中消失。这些数据为多能干细胞在CNAs具有异质性这一论点提供了证据。

研究人员在文章中总结到:SNVs对诱导多能干细胞技术培育小鼠存活率递减的确切影响需要未来的进一步研究。而且,与连续体细胞核移植实验相比,多能干细胞系可能经历了来自细胞体外培养的压力导致突变率的上升。因此,直接重编程策略和添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂的方法共同作用可能可以消除异常的克隆胚胎,使得利用体细胞核移植可以连续克隆培育小鼠至25个世代变得更加容易。本次研究促进了人们对基因突变与机体发育之间关系的理解,而准确理解基因突变与机体发育的关系对临床前筛选生物安全的诱导多功能干细胞必要的。

研究人员还提醒:对多个连续的结果进行比较后发现在多功能干细胞存在一种特殊模式的CNAs,这一现象在过去基于成对比较的研究中被忽略。PCRSanger测序数据以及基因组测序数据都可以证明在多功能干细胞中存在重复序列的CNAs,而在其对应的分化细胞和体细胞中这些CNAs消失了这一现象的存在。这些细微的基因改变都发生在多功能干细胞,说明多功能干细胞可能拥有一套相同的自我更新机制。

参考文献:

Unique features of mutations revealed by sequentially reprogrammed induced pluripotent stem cells.Gao, S., et al. Nat Commun.2015 Feb.

作者简介:

高绍荣:北京生命科学院研究所研究员。北京生命科学研究所高绍荣试验小组工作主要集中于研究哺乳动物体细胞重编程的分子机理。

田见晖:中国农业大学动物科技学院副院长兼党总支副书记。主要从事卵母细胞成熟与胚胎发育调控、诱导多能干细胞(iPS)重编程等方向的研究。

蔡军:中国科学院北京基因组研究所研究员。清华973国家重点基础研究发展计划项目《基于新一代测序的生物信息学理论与方法》第五课题组学术骨干。从事多年的计算生物学和基因组学方向的研究工作。