对浊红球菌转化脂滴的动态变化研究

浊红球菌Rhodococcus opacus PD630 (R. opacus PD630),是一种为数不多的含有脂滴(LDs)的原核生物。LD是脂类的重要存储细胞器,对细胞间的沟通和能量代谢有着重要作用,但是人们对这个细胞器了解还有待研究。为了逐步建立并完善脂滴研究的平台中国科学院生物物理研究所研究员刘平生合作基因组所于军研究员课题组以及清华大学等处研究人员,利用基因组学、蛋白质组学(Proteomics)、转录组学、及系统生物学方法,在基因组所于军课题组的协助下,PD630这株高效产油菌展开了系统性研究。首次测序并公布了该产油菌的全基因组信息、脂滴蛋白质组信息,和转录组学数据。该成果发表在201310月《Nucleic Acids Research》杂志上。

研究人员使用浊红球菌R.opacus PD630为模式系统,对脂滴的形成及动态变化进行了初步研究。首先,对该菌种进行全基因组测序,发现其全基因组大小为9.1 Mbp,包括一个环形的染色体和9个自身质粒。其次,纯化了R.opacusPD630中的脂滴并通过形态学和生物化学的方法鉴定了脂滴的纯度。然后通过一次切带和两次shotgun的质谱方法分别得到了430299305个脂滴蛋白。大部分脂滴蛋白属于代谢性的酶类,其它的包括膜转运相关蛋白、转录翻译相关蛋白、细胞分裂相关蛋白以及分子伴侣蛋白等。 基于蛋白质组学的分析,研究人员选定一些蛋白对其进行初步的功能研究。

浊红球菌R.opacus PD630基因组表现出强大的生物合成和分解代谢的能力

研究人员使用Roche/454Illumina的测序的方法,通过基因组测序与拼接,结合该菌株的转录组分析结果,发现R.opacus PD630基因组可能包括1个环形主基因和9个自身质粒,总长度9.1Mbp,其中基因组长度为8 376 954 bp,而在这些8947个基因中大部分为脂质运输和代谢途径相关基因。

图1.R.opacus PD630基因组的基本统计信息

脂质存储的全基因表达

研究人员为了观察R.opacus PD630在不同培养条件下脂滴出现的不同形态,将菌株分别培养在NB培养基,然后转移到MSM培养基 3小时(MSM3)和24小时(MSM24)。在MSM培养基中氮源缺乏而碳源充足,根据在NBMSM培养中差异基因表达系统的比较分析,揭示蛋白质对TAG的积累和LD动态变化的影响。结果显示在NB培养基中TAG含量较少,并且脂滴也较小,而在MSM培养基中菌体内积累大量的TAG,所以脂滴相对体积较大。当细胞从NB改为MSM条件时,对环境变化的急剧反应,经过24小时观察。通过差异表达基因的功能富集分析显示,基因类别J(翻译、核糖体结构和生物转化)显著下调,而基因类别K(转录),G(碳水化合物运输和代谢)C(能源生产和转换)表达下调。核糖体蛋白的表达增加的数量与以MSM3处理的基因上调数是一致的。蛋白质上调的比例和其功能丰富的组织展现出蛋白质对PD630脂质动态变化的影响。

图2.全基因组差异表达分析

涉及TAG生物合成和代谢酶

TAG R. opacus PD630中的积累维持脂质合成和降解的动态平衡。经过系统地分析蛋白质可能参与TAG的生物合成和代谢途径。该通路有22个反应,涉及457候选酶。这些反应进一步分为五个阶段:起初脂肪酸生物合成,TAG生物合成,TAG存储,TAG降解和脂肪酸降解。在这些反应中,许多酶高表达或差异表达,表明当环境改变时,大多数脂肪酸在R. opacus PD630合成和分解代谢中是有差异的。这些蛋白质可分为一些子群集与每个集群通过系统发育分析相似的表达模式。例如,LPD00874LPD02749都在MSM3增加,然后在MSM24的下降。类似的趋势也在中LPD00891LPD03041LPD01667观察到。这些结果提出了一个精确的预测,这些差别表达的脂肪酶/酯酶可能参与TAG的合成和降解。

鉴定与蛋白质相关的原核LD

为了更好地了解原核LD蛋白,研究人员分离LD,并完成蛋白质和脂质分析。首先,确定孤立的LD的质量。使用阳性分离LDTEM成像显示来自其它膜的一些污染物。从总细胞膜总脂质分离的LD,通过TLC分离。结果表明,主要的脂质本为TAG,并且该总的膜级分富含磷脂酰乙醇胺,也含有未知的脂质。LD的蛋白质组合物是从明显不同的总膜,胞液和全细胞裂解物,进一步验证所得到的分离的LD高品质物质。

图3.参与TAG生物合成和降解的基因家族表达和系统发育分析

然后,研究人员进行了LDs不同培养条件下分离比较蛋白质组学研究,并专注鉴定与LD功能和动态变化有关的蛋白质。在LDs确定的430蛋白质被分为九组,其中包括231酶,6转运蛋白,25转录和翻译的蛋白质,31核糖体蛋白,5伴侣蛋白,8胁迫诱导蛋白,5细胞分裂相关蛋白和110其他未知功能蛋白质。231酶主要参与脂质合成和降解,其中包括40转移,8连接酶,37脱氢酶,32还原酶和29合酶,总结出这些酶大于63%。

图4.LD蛋白质的功能表达分析

参与LD动态的蛋白

整合转录组和蛋白质组数据来揭示蛋白质参与的LD动态是一个有效的方法。LD蛋白质组转录组分析显示,在NB,MSM3MSM24条件下大于 50%430个蛋白质显著差异表达不同。在430个基因从NBMSM3177被显著上调,而30个基因的表达下调,这表明这些蛋白参与的LD重要功能与培养条件改变有关。因为Dynamin-like蛋白和SNARE-like蛋白在真核生物中LD出芽和融合过程中扮演很重要的角色,他们存在于R. opacus PD630中,表明这些蛋白质也可以调解LD在原核生物的动态,因此来展现出他们的进化起源。到目前为止,这些综合组学研究系统显示出与原核的LD动态,尤其是脂质合成、储存和LD形态有关的诸多因素。

结构蛋白对原核LD形态的影响

在所有可能参与LD动态蛋白中,研人员进一步确定蛋白质LPD06283作为结构式蛋白质。并观察到,它参与了LD动态变化。脂滴主要蛋白之一的Apolipoprotein家族蛋白LPD06283,经基因敲除后突变株中的脂滴相对于野生型脂滴明显变大。LPD06283与早些时候报道蛋白质在 RHA1Ro0210和在PD630TadA序列相似。这些结果与早期的研究表明LD被容易融合在缺少结构蛋白,并与在真核细胞的早期研究也是一致的。

图5.LPD06283缺失导致LDs变大

LD是在这两个原核生物和真核生物的重要细胞器,但很少有人知道有关它的功能,动态和发展。R. opacus PD630是调查LD的一个有用的模型,因为LD是唯一的细胞内细胞器膜。研究人员全面介绍了R. opacus PD630的基因组,转录组和蛋白质组LD,并系统地研究了可能参与LD动态和功能的关键蛋白。综合显示显著差异177 LD蛋白质表达,这些组学数据描述原核LDTAG积累培养一个动态现象。这些结果不仅证实了在早期的研究中LD蛋白质,也指出了许多新的候选蛋白用于优化TAG合成和储存。

比较蛋白质组学PD630 LD表面检测到大量蛋白,包括酶,转运蛋白,细胞分裂相关蛋白,转录/翻译的蛋白质,核糖体蛋白质和许多其它未知蛋白。这些不同的蛋白质表明原核LDs,如在第一细胞内膜系统,是参与脂质代谢和其他重要的细胞功能。此外,LD蛋白这种多样性在此前报道蛋白质组学,也观察到来自多个物种,如绿藻,酵母菌,果蝇,小鼠,这表明从原核生物到哺乳动物的进化之路。例如,许多核糖体蛋白中发现PD630LDs。存在线虫和果蝇胚胎中但不存在于小鼠中的LDs。广泛的原核LDs和哺乳动物的LDs的专业化进行功能建议,除其他生化过程的分布伴有其他细胞器,而且它是一个从原核生物到真核生物的LD进化过程中继续进行的趋势。

作者还提醒:在原核和真核细胞中,LDs具有脂质由磷脂单层封装相同的拓扑结构。从拓扑视图,LD应该进化构建由细胞本身,以及细胞器,如线粒体和叶绿体,可能与原来通过融合原核细胞是完全不同的。已经提出了应变PD630 LD个体发育的早期模型LDs起源于细胞质膜。在对脂滴动态变化相关基因的研究中,研究人员们主要对SNARE-like蛋白进行分析,发现这类蛋白主要定位于菌体质膜上。但这些蛋白究竟怎样参与到脂滴的形成和动态变化的过程中还需要进一步的研究和探讨。作者们认为,完整的R. opacus PD630的基因组,转录组和蛋白质组LD这里提出不仅为解开LD动态机制,同时也为研究细胞器和真核生物进化的出发点。

参考文献:

Integrated omics study delineates the dynamics of lipid droplets in Rhodococcus opacus PD630. Liu P et al.Nucleic Acids Research. 2013 Oct.

作者简介:

刘平生:中科院生物物理所,生物大分子国家重点实验室,创新课题组组长主要以脂滴研究为基础,开展脂质储存和代谢与相关疾病,特别是糖尿病机制的探索研究,以及利用微生物进行生物能源的开发。

于军:中国基因组学科学家,华大基因研究中心(中国科学院北京基因组研究所)的主要创始人之一,曾任中国科学院北京基因组研究所副所长。目前担任国家科技部重大科学计划转录组研究首席科学家。

张奇伟:清华大学信息学院与医学院双聘教授,清华信息国家实验室合成与系统生物实验室主任,首批千人计划教授。清华973国家重点基础研究发展计划项目《基于新一代测序的生物信息学理论与方法》第三课题组负责人。主要科研领域与方向:计算生物学与生物信息学;合成生物与系统生物学。