E2F家族的特殊成员E2F7在细胞衰老过程中连通了p53肿瘤抑制通路与视网膜母细胞瘤蛋白通路

致癌基因诱发细胞衰老能够限制致癌的转化,作为一种抗增殖压力反应程序受p53肿瘤抑制通路和视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma proteinRB)通路的调节。E2F7E2F家族唯一一个在致癌基因诱发细胞衰老过程中表达量显著上调的转录因子,是p53基因直接作用的靶点。一旦E2F7表达量上升,E2F7能结合并抑制一系列E2F转录因子的靶基因,而且E2F7RB共同协作使细胞周期停滞限制致癌的转化。RB的破坏能够引发E2F7进一步增加,使细胞周期进入第二个监测点,阻止已经完成异常DNA复制的不受约束细胞的分裂。从机理上说,RB的减少影响了RB对有丝分裂相关E2F靶基因的抑制作用,而E2F7的上调能起到补偿作用。美国纪念斯隆凯特林癌症中心、冷泉港实验室以及清华大学的研究人员合作,发现E2F7在致癌基因诱发细胞衰老过程中起着重要作用,对E2F7的研究揭示了p53肿瘤抑制通路和视网膜母细胞瘤蛋白通路之间存在一种新的关联方式。该成果发表在20126月《GENES & DEVELOPMENT》杂志上。

在细胞衰老期间E2F7表达量上升

IMR90是人类正常的二倍体纤维母细胞,也是研究细胞衰老的经典模型。利用生物技术方法使IMR90细胞表达能抑制各个RB家族成员的shRNAs,同时致癌的Ras基因使IMR90细胞进入衰老阶段。对上述IMR90细胞用Affymetrix U133 Plus 2.0 microarrays进行转录表达谱的研究。对比各个细胞阶段的转录表达谱数据,发现E2F家族的E2F7在衰老阶段的细胞中表达有差异,显著高于同一家族的其他转录因子。与此相反的是,对由于生长因子匮乏而进入生长停滞期的细胞来说,E2F7表达量下降,推测E2F7上调不是细胞周期停滞引起的结果。这些结果表明E2F7很可能在细胞衰老过程中起到重要作用。

细胞不同时期(Ggrowing)、Qquiescent)、Ssenescent))E2F7表达量比较如上图

E2F7p53基因的一个直接靶基因

目前,参与细胞衰老的转录因子中研究最充分的是p53p53是一个序列特异性的DNA结合因子,能够结合到10bp模体5’-PuPuPuC(A/T)(T/A)GPyPyPy-3‘2个拷贝上。有趣的是,在E2F7基因的启动子上有p53的结合位点。

为了确定p53结合到E2F7启动子上是否会影响其转录,需要验证p53结合到E2F7基因启动子上是否能将p53效应传递给一个杂合启动子以及是否在p53基因受抑制时E2F7依旧能诱导细胞进入衰亡状态。在E2F7启动子上p53的结合位点相关序列或一个包含p53结合位点携带突变位点的序列被克隆到一个荧光素酶报告基因的上游,这个重组基因和p53表达载体一起转染到已经敲除p53基因的HCT116细胞。通过生物发光测定荧光素酶的表达量。正如所料,转染了野生型报告基因的细胞荧光素酶表达量显著上升,但是携带突变体的细胞荧光素酶表达量没有上升。同样的,E2F7诱导的细胞衰老过程中需要p53。当处于衰老状态的IMR90细胞含有中性的shRNA时,依然可以诱导E2F7基因产生mRNA和蛋白质响应致癌的Ras基因,但是当IMR90细胞含有p53shRNA时,这种机制就被破坏了。因此,这些数据结果验证E2F7基因是p53的靶基因。

E2F7p53基因的一个直接靶基因实验结果如上图

E2F7RB相互协作促进细胞衰老

考虑到研究人员已经发现E2F7基因是p53一个直接的靶基因且在细胞衰老期间表达量上调,研究人员开始设计实验验证在这种环境下E2F7是否有助于p53信号的输出。所有的IMR90细胞被改造成表达2种独立的能单独抑制E2F7蛋白表达的shRNAs或者串联能够抑制RBshRNA,检测这些细胞通过致癌基因诱导启动细胞衰老的能力。通过检测细胞衰老标志性表达产物评估急性诱导衰老能力或检测5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-29-deoxyuridineBrdU)渗入DNA的量评估DNA复制被抑制的程度。这些细胞在低密度下培养形成肉眼可见的细胞群落的能力用来评估细胞的长期繁殖能力。

正如以前的报道,RB的抑制影响细胞衰老,因为实验检测到细胞衰老标志物,例如SA-β-gal活性和SAHF形成的减少,这些细胞还依然处于静止状态,因为这些细胞中BrdU渗入量减少,而且不能形成肉眼可见的细胞群落。单独抑制E2F7对细胞表现衰老表型没有影响,虽然,原则上来说,这种结果可能是由于E2F7shRNAs没能完全抑制E2F7蛋白表达造成的。但是,与以上结果形成鲜明对比的是,通过对各种繁殖能力指标的检测分析,例如BrdU渗入量、细胞群落的形成、细胞数量等,发现对E2F7RB的共同抑制能够使细胞避开细胞衰老的生命周期。因此,E2F7联合RB通路共同促进细胞衰老。

E2F7联合RB通路共同促进细胞衰老如上图

同时抑制RBE2F7转化小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblastsMEFs

有研究报道,p53也能通过控制MEFs的衰老而限制Ras基因促进恶性转化的能力。为了检验E2F7是否也参与了这一过程,研究人员针对E2F7基因设计了多重shRNAs,然后将多重shRNAs和致癌的Ras基因一起导入发育早期的MEFs。由此产生的细胞群随后评估它们在体外试管中启动细胞衰老程序的能力或者经皮下注射经免疫功能不全的小鼠体内评估它们形成肿瘤的能力。与能表达针对p53shRNAsMEFs细胞不同,表达E2F7基因的shRNAs的细胞依然能够响应致癌的Ras基因诱导而启动细胞衰老程序,因为检测到细胞中SA-β-gal活性的积累、BrdU渗入量减少以及在培养皿中无法形成可见的细胞群落。同样的,这些细胞不能在活的有机体内引发肿瘤。显然,这些反面的结果不仅仅是由于不完全的E2F7基因敲除引起的,因为来源于缺失E2F7基因小鼠的MEFs也能为了响应致癌的Ras基因诱导细胞衰老出现生长停滞。因此,在这种情况下,破坏E2F7不能完全出现类似细胞p53基因丢失导致MEFs绕开细胞衰老这一生命周期的现象。

为了验证在MEFsE2F7RS联合能否发生像在人类纤维母细胞中出现的促进细胞衰老的现象,研究人员构建了一系列能够同时作用于E2F7基因和Rb基因的shRNAs,检验它们在上述条件下调节细胞对致癌的Ras基因诱导细胞衰老响应的能力。同时表达E2F7基因和Rb基因shRNAsMEFs没有表现出任何衰老迹象,而且持续渗入BrdU。但是,相比如RB缺陷的细胞,能够同时表达针对E2F7基因和Rb基因shRNAs的细胞在长久持续繁殖能力上显著提高,而且在活性小鼠体内能诱发肿瘤。

RBE2F7同时受抑制能够促进转化如上图

E2F7结合并抑制一系列E2F靶基因

研究人员的研究结果证明E2F7基因是p53诱导细胞衰老的一个关键靶基因,而且E2F7可以参与组成抑制细胞无限增值第二道屏障。与这种观点相符的是,在表达针对RBshRNAsIMR90细胞中,细胞衰老程序能正常启动,同时E2F7高表达,导致与E2F7相关的核染色质相应增加。为了鉴定E2F7在细胞衰老过程中的靶基因,研究人员对含有对照shRNA或针对RB shRNA处于生长期、静止期或衰老期的IMR90细胞利用抗E2F7抗体的CHIP-seq进行研究。虽然在生长期、静止期或衰老期的总体峰值相对偏小,但是表达针对RBshRNAs的衰老期IMR90细胞中,E2F7结合位点峰值明显上升。

为了验证E2F7是否与已知的转录因子结合位点相关联,研究人员在300个重要的E2F7富集的区域从头开始进行模体分析。与研究人员全局分析结果一致,在衰老期细胞中,E2F7结合到E2F1基因启动子区域的数量大幅度增加。但是,研究人员注意到其他位点也有很明显的特异性结合,提示E2F7可能也结合基因组的其他区域。

与生长期和静止期细胞相比较,处于衰老期的细胞中E2F7结合到E2F靶基因的数量显著上升。

基因本体论分析揭示了在缺乏RB细胞中,被E2F7结合的E2F靶基因都是在有丝分裂过程中起重要作用的基因。处于衰老期的细胞,无论是否含有RBE2F7都能结合到E2F1基因,与此不同的是,E2F7结合在MAD2L1基因和BUB3基因启动子区仅仅发生在RB受抑制细胞启动的衰老过程中。综合以上结果,推测E2F7主要抑制参与有丝分裂的基因,特别是在RB功能受损的细胞中。

衰亡期E2F7结合到一系列E2F靶基因如上图

E2F7补偿RB缺失对有丝分裂细胞周期的影响

为了验证哪些基因的表达受E2F7的影响,研究人员对上述细胞进行转录表达谱分析,特别关注那些细胞中E2F7RB同时失活对表现为协同作用基因的影响。对不同条件下,例如生长期或衰老期,细胞中表达量明显有差异的基因进行基因本体论分析并对受E2F7影响的基因按照功能进行分类。

有丝分裂相关的基因在RB缺陷或E2F7缺陷的细胞表达量都很少,但在RBE2F7同时缺陷的细胞中这些基因表达活跃。因此,虽然E2F7DNA复制基因的抑制是可有可无的,但是它可能与RB共同作用来抑制有丝分裂相关基因。

通过分层聚类研究人员的基因表达数据或直接对E2F靶蛋白进行免疫印迹法可以得到相似的结论。因此,RB受抑制的细胞与借助于上调与DNA复制相关基因簇表达形成的正常衰老细胞有显著差异。形成鲜明对比的是,在E2F7RB共同受抑制的细胞中,有丝分裂相关基因簇和DNA复制相关基因簇的表达都上调了。因此,当DNA复制因子MCM3RB缺陷细胞中高表达时,它的表达不会因为E2F7受抑制而受到影响。有丝分裂细胞周期的关键组件,如细胞周期素A、细胞周期素BCDC2仅在RBE2F7同时缺陷的细胞中高表达。重要的是,E2F7和有丝分裂周期抑制的关系不是细胞周期繁殖产生的结果,因为研究人员的ChIP-seq分析显示,这些基因是E2F7的靶基因。

E2F7补偿RB在衰老细胞中控制基因表达的功能如上图

E2F7阻碍RB缺陷细胞正常细胞周期进程

为了验证E2F7对细胞周期进程的影响,对致癌的Ras基因诱导的衰老IMR90细胞,研究人员检验了针对E2F7RBshRNAsDNA含量的影响。除此以外,在WI38的二倍体成纤维细胞中检测E2F7RB对响应致癌基因的细胞的细胞周期分布的影响,同时在一个能表达可控制的针对p53shRNA、可通过野生型p53表达重建细胞衰老状态并由Ras基因转化的肝母细胞系中也检测E2F7RB对响应致癌基因的细胞的细胞周期分布的影响。

有趣的是,处于静止状态的细胞最终保留了高水平的细胞周期素E、低水平的细胞周期素B和磷酸化组蛋白H3,出现一种类似有丝分裂失败或内复制的表型,而不是细胞处于G2期或M期的表型。形成鲜明对比的是,对RBE2F7同时抑制可以减轻这种表型,阻止多倍体细胞的出现,重建正常的细胞繁殖周期。在RB的存在下,单独抑制E2F7也能减少四倍体细胞的积累,推测它能约束由于RB缺失而混乱的细胞周期。在WI38的二倍体成纤维细胞和Ras基因转化的肝母细胞系也观测到了类似的现象。因此,在人类和小鼠的细胞中,在RB缺失而引发细胞异常繁殖的情况下,E2F7能控制细胞周期的关键点而补偿RB的功能。

E2F7加强细胞周期的第二个监测点进而支撑RB的功能如上图

在细胞衰老过程中E2F7起着重要作用,而细胞衰老可以作为阻止肿瘤发生的一道屏障,因此,E2F7很可能成为一个肿瘤抑制基因。E2F7RB同时失活促进纤维母细胞的恶性转化,这一结论很好的支撑上述观点。E2F7基因位于chr12q21,有研究报道,在胰腺癌患者中这一区域时常发生缺失,而且携带这一缺失突变的病人的治愈后状态也很差。有趣的是,从胰腺癌的遗传学特征推测,这将是通过致癌诱导细胞衰老限制肿瘤发生的一个很好的模型,正如在疾病的晚期,激活的KRA基因突变通常与针对INK4A/ARF基因位点或p53的突变一起发生。E2F7表达量的降低也使得卵巢癌患者的存活率下降。尽管如此,在体细胞中尚未发现E2F7基因突变,很可能E2F7不是肿瘤发生的速率限制因素。E2F7在肿瘤抑制中所扮演的角色有待于在老鼠模型中进行更加深入的研究。无论如何,研究人员的研究阐明了E2F7在细胞衰老中所发挥的功能,揭示了E2F7RB肿瘤抑制网络之间补偿机制的重要性。

参考文献:

Ozlem et al. (2012).The atypical E2F family member E2F7 couples the p53 and RB pathways during cellular senescence. Genes Dev. 2012 Jul 15;26(14):1546-57. doi: 10.1101/gad.196238.112.

作者简介:

Ozlem Aksoy:美国纪念斯隆凯特林癌症中心、冷泉港实验室研究员,本文第一作者。

Scott W. Lowe:美国纪念斯隆凯特林癌症中心、冷泉港实验室研究员,本文通讯作者。

汪小我:清华大学自动化系副教授,国家自然科学基金评审人。清华973国家重点基础研究发展计划项目《基于新一代测序的生物信息学理论与方法》第四课题组学术骨干。主要从事生物信息学与系统生物学方面的研究。