通过合成与系统生物学方法揭示microRNA定量调控规律

microRNAmiRNA)是一类由22个左右核苷酸组成的短的非编码RNA,通过与目标mRNA结合抑制特定靶基因表达,在动植物中起到重要的转录后调控作用。miRNA可以与多种在核苷酸序列上与其互补相似的mRNA。当miRNA表达量一定时,所有的靶RNA通过与miRNA的竞争性结合消耗细胞内游离的miRNA,从而影响其对其他靶基因的调控,这一现象被称为竞争性内源RNAceRNA)效应。ceRNA在转录后的水平是受到互相间的交叉调节。清华大学自动化系以及信息学院的汪小我副教授合作清华大学谢震研究员带领团队通过使用合成基因线路建立了一个计算模型来定量描述一个最小的ceRNA网络。并在人类细胞里进行了实验验证,证明ceRNA调节的范围和强度是由ceRNA的丰富度与miRNAceRNA结合的强度所决定的。发现在部分和完美互补的靶RNA存在一种单向的竞争效应,而这主要是由于这两类调节中不同的miRNA消耗的速率不一致。此外研究人员还发现通过加入更多的小干扰RNAsiRNA)能够对miRNA类似的脱离高表达浓度和强结合位点的靶RNA是一种有效的补偿措施。该研究刊登在20153月的《PNAS》杂志上。

最小的miRNA–ceRNA模型与实验设计

为了分析ceRNA效应的定量表现,研究人员受到之前一些其他关于miRNA定量调节研究的启发,建立了一个只含两种mRNA并被一种miRNA调节的最小miRNA–ceRNA模型。通过一些数学公式的推导,使得能定量分析模型里各种成分的变化关系。基于模型设计一个合成基因线路,使得能在特定调控方式下定量研究ceRNA效应。接着研究人员使用DNA质粒将设计好的合成基因线路导入293细胞系,进行实验验证。

miRNA–ceRNA相对丰度决定ceRNA脱抑制效应的范围和大小

为了研究miRNAceRNA的相对丰度是否能影响ceRNA调节,研究人员使用建立好的模型在不同miRNA表达水平下进行模拟计算。结果显示整个模型在特定miRNA浓度下需要ceRNA1达到一定数量级的浓度才能发生ceRNA2介导的ceRNA1脱抑制效应。这个模拟计算的结果在相应的实验中也得到了验证。

mRNAmiRNA的结合强度影响ceRNA调节效率

接着使用不同的miRNAmRNA结合强度作为变量对模型进行模拟计算,结果显示miRNA与靶标的结合强度强烈影响ceRNA调节效率,但是不直接改变ceRNA介导的脱抑制效应的有效作用范围。在293细胞实验中也能得到一致的结论,当ceRNA2miRNA之间有更强的结合强度,能观察到更强的ceRNA效应。

ceRNA增强miRNA抑制的阈值行为

紧接着,研究人员进行miRNA的剂量--反应曲线分析,研究ceRNA2的表达是否会影响ceRNA1miRNA抑制效果的水平。计算模拟和实验结果都同时说明当miRNA表达水平低于一个特定浓度时,ceRNA1的水平对miRNA表达量变化并不敏感;而一旦miRNA的浓度超过这个阈值,ceRNA1的反应开始变得敏感起来。有意思的是,当提高ceRNA2的表达,不仅将提高miRNA的浓度阈值,而且使ceRNA1miRNA超过该阈值浓度下的反应变得更为敏感。

部分和完全配对靶标之间的单向竞争效应

由于miRNA/siRNA与其靶RNA互补配对的程度决定其通向两条走向基因沉默信号通路中的哪一条,研究人员为研究当它们共用一种miRNA/siRNA时这两种信号调节是否会相互干扰进行试验设计。结果显示当一种ceRNA部分匹配时,会明显改变另一种ceRNA的抑制效果,而当ceRNA完美匹配时则几乎不会改变。

基于多样的ceRNA系统推导有效的RNAi抑制设计原则

使用RNAi技术抑制目标基因的表达是生物实验中常用的方法,而其中的脱靶现象与ceRNA效应密切相关。在所建立的模型中,ceRNA1模拟了脱靶抑制的调节方式,ceRNA2可以看做实际希望抑制表达的目标RNA。利用该模型构建了一个中靶--脱靶相关抑制图来表示在不同miRNA表达水平下中靶和脱靶的下调效率。通过该图能够使设计者在设计miRNA/siRNA时,尽量减少RNAi的脱靶现象。

对内源性miR-21靶标的影响

为了研究合成的ceRNA对内源性miR-21靶标的影响,研究人员通过RNA测序、定量RT-PCR等实验得出,合成的基因在转录组中是有着很大范围的表达。

研究人员将系统生物学建模分析与合成生物学实验相结合,建立了miRNA调控的数学模型,构建对应的合成基因线路并导入293细胞中验证ceRNA效应,证实了靶RNAmiRNA浓度对ceRNA效应的阈值现象,发现了miRNA的靶位点结合能力对ceRNA效应强度影响的函数关系,阐述了miRNA通路和RNAi通路的单向竞争效应,并从理论上提出了RNAi技术的改进方向。这一工作,是将生物信息学、系统生物学与合成生物学相结合,定量揭示基因调控规律的一个成功范例,其科学发现为理解复杂的microRNA调控系统和未来用RNAi技术有效设计疾病基因靶向治疗等提供了理论基础。

参考文献:

Model-guided quantitative analysis of microRNA mediated regulation on competing endogenous RNAs using a synthetic gene circuit. Ye Yuan,et al. PNAS. 2015 Mar.

作者简介:

汪小我:清华大学自动化系副教授,国家自然科学基金评审人。清华973国家重点基础研究发展计划项目《基于新一代测序的生物信息学理论与方法》第四课题组学术骨干。主要从事生物信息学与系统生物学方面的研究。

谢震:清华大学国家实验室生物信息学部特别研究员,“青年千人计划获得者。主要研究方向为合成生物学,基因线路组装与基因组整合技术平台开发,以期开拓合成生物学在癌症基因治疗、细胞治疗和疫苗开发上的应用。