表观修饰的MiR-429与RBBP4相互作用可以促进肝脏肿瘤起始细胞的性能

解放军第二军医大学上海东方肝胆医院王红阳院士、陈磊研究员带领研究人员对经过表观修饰的miR-429特异性结合Rb结合蛋白4(the Rb binding protein 4,RBBP4)、E2F转录因子1(E2F transcription factor1 ,E2F1)和POU第5家族同源蛋白1(POU class 5 homeobox 1 ,POU5F1 or OCT4)对肝脏肿瘤起始细胞(tumour-initiating cells,T-ICs)起促进生长的作用,这个结论提示针对miR-429及其下游的基因可以创造一种抑制或治疗肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma ,HCC)的新途径。该成果发表在2014年2月《Gut-BMJ》杂志上。

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma ,HCC)是全世界引起死亡率最高的十大癌症之一,在中国特别常见。越来越多的证据表明肝脏T-ICs对肝癌发生起决定性作用。随着对HCC和肝脏T-ICs研究的深入,许多人开始研究肝脏T-ICs功能调节的内在机制。

miRNA是细胞中一类含量丰富的非编码RNAs,具有抑制翻译或结合到目标mRNAs分子的3‘UTR引起mRNA降解的功能。miRNAs被认为是肿瘤的激活子或抑制子,调节肿瘤或T-ICs的生长。miR-429是在进化上保守miRNAs家族中的一员,这个miRNAs家族还包括miR-200c、miR-141、miR-200b和miR-200a,这些miRNAs在不同的上皮组织中表达。miR-429在很多普遍发生的上皮细胞癌中发挥着不同的作用。

miR-429在人类胃癌组织和乳腺的恶性肌上皮瘤组织中表达量下调,而miR-429的过度表达引起卵巢癌细胞的间充质干细胞向上皮细胞的转化,低水平表达miR-200b-429预测得不到理想的结果。相反,miR-429在人类结直肠癌组织中表达量上调,且与肿瘤大小、淋巴结转移和预后较差等有着密切的关系。miR-429在子宫内膜腺癌和浸润性膀胱尿路上皮癌中表达量也上调了,在肿瘤发生中扮演这重要角色。在高度转移性胰腺导管腺癌细胞系中发现miR-429具有一个显著特征。除了在人类胚胎干细胞分化过程中特异性表达以外,miR-429在胰腺癌干细胞中也是特异性表达。但是,HCC是最普遍的上皮细胞癌之一,miR-429在HCC和肝脏T-ICs中表达量没有显著差异。

miR-429能够在HCC组织中富集,也是一个重要的预后因素。相关回归分析表明miR-429的高表达与HCC多种恶化特征相关。肿瘤直径和miR-429的表达水平是相互独立的,但它们是影响HCC病人存活率的重要因素。

在肝脏T-ICs中miR-429富集

肝脏T-ICs细胞中特有的标记分子有EPCAM和PROM1(CD133)。研究人员进一步在高表达EPCAM和PROM1(CD133)的HCC组织中检验miR-429的表达量。实验结果表明在高表达EPCAM和PROM1(CD133)的HCC组织中miR-429表达升高。同时,在未分化的球体中干细胞相关基因的表达量也升高了。

miR-429促进EPCAM+肝脏T-ICs的性能

与负对照(negative-control,NC)和突变的antagomiR-429处理细胞相比,将antagomiR-429引入EPCAM+HCCLM3细胞中,除了CD133+细胞以外,EPCAM+细胞比例显著下降,妨碍恶性细胞的增值和细胞周期,抑制肿瘤球状体的生长,改善了化疗耐药的情况。相反,与miR-NC或miR-429突变的模仿组相比,在试管内外在因素使EPCAM-HCCLM3细胞表达miR-429可以促进恶性增殖、自我更新和化学耐药,T-ICs的比例也升高。

miR-429直接标定RBBP4

在至少3个细胞系中发现miR-429与SLC38A4、RBBP4、ACVR1C、EIF5B、EDEM3和RASSF8表达量呈负相关关系,在多HCC细胞系中这六个基因是miR-429的靶基因。与其他五个靶基因相比,只有RBBP4的抑制能导致EPCAM+T-ICs比例显著上调,这说明miR-429主要通过RBBP4控制肝脏T-ICs。

  

miR-429减少RBBP4表达,通过E2F1引起POU5F1(OCT4)转录被激活

miR-429过量表达或敲除RBBP4能使KLF4、POU5F1(OCT4)、MYC和SOX2基因的mRNA和蛋白质表达水平显著上调。与负对照细胞相比,感染miR-429的细胞OCT4基因启动子区域招募到更多的E2F1,其他三个基因没有启动子区域E2F1的招募情况没有显著变化。

异常的CpG甲基化使肝脏T-ICs中miR-200b、miR-200a和miR-429基因簇表达量上升

miR-200b、miR-200a和miR-429基因在Chr1上成簇存在,在各种各样的癌症细胞中高表达,在胰腺癌细胞中甲基化水平低。因此,研究人员推测基因启动区异常CpG甲基化导致HCC中miR-429增加。实验结果表明在miR-429高表达的HCC细胞系中,有几个CpG区域甲基化水平显著下降,其中四个区域在EPCAM+HCCLM3和SMMC-7721细胞中出现相似的低甲基化,但是在EPCAM-中没有。而且,与正常肝组织相比,这四个区域的低甲基化状态经证实出现在HCC极早期。

隐藏的miR-429作为一个潜在的信号分子介导细胞间通讯

在细胞结构中miR-429的表达与微囊(Microvesicles ,MVs)中miR-429的水平正相关。HCC早期病人的血浆中miR-429的表达量与组织中miR-429水平正相关,推测在HCC组织中高表达的miR-429通过外质体包装后分泌到血浆。混合共培养实验表明在HCC组织中高表达的miR-429在MVs中被秘密运送到周围的目标细胞中。

本文是研究人员第一次报道miR-429表达量升高对HCC病人的存活时间和肿瘤复发产生重要影响。miR-429优先在EPCAM+细胞和富含球状体的肝脏T-ICs细胞中表达。功能实验显示miR-429在T-IC功能发挥中起着重要作用。miR-429的过度表达使EPCAM-细胞中干细胞相关基因的表达量上升,导致细胞自我更新能力增强、对化学疗法的抗性增强以及肿瘤发生概率增加。相反的,在EPCAM+细胞中对miR-429进行抵抗则会导致相反的效果。有趣的是,研究人员在CD133+HCC组织和挑选的HCC细胞中也发现miR-429的富集,但是加强miR-429的表达对CD133+或CD133-细胞没有明显的影响,说明每种类型的T-IC可能在调节自身功能和自我扩张方面有不同的方式。

通过完整的mRNA表达谱分析,软件预测和功能研究,研究人员鉴定出RBBP4是miR-429下游发生作用的靶标。从体内和体外的研究可知RBBP4是一种可以抑制多种肿瘤细胞生长的肿瘤抑制蛋白。E2F1和RBBP4通过RB1和组蛋白去乙酰化酶联系在一起,推测miR-429通过控制RBBP4的表达而达到调节E2F1转录活性的目的。而且,干细胞相关的OCT4基因被证明是一个E2F1应答基因,OCT4基因在miR-429过量表达或RBBP4被敲除的情况下表达量上调。进一步表达量分析发现在肝脏T-ICs中miR-429和RBBP4呈负相关关系,暗示RBBP4可能在肝脏肿瘤发生过程中起决定性作用。根据研究人员目前的了解,在肝脏T-ICs中RBBP4扮演的潜在角色是以前没有报道过的。研究人员发现敲除RBBP4促进BBT-ICs的自我更新和肿瘤发生。

虽然有几个基因与T-IC依赖的启始、发展、转移和对治疗的抗性等有关,但是在肿瘤发展过程中,T-IC的功能、T-IC的生态位和T-IC周围的正常细胞之间相互调节的分子机制很多都是未知的。基于研究人员的结论,研究人员假定隐藏的miR-429能够通过MV介导的细胞间交换进入周围的细胞,为细胞的自我繁殖、自我更新、肿瘤发生、化学抗性和恶性转移提供了一个自由的入口。

在Chr1p36区域miR-200b、miR-200a和miR-429基因簇上游存在四个异常的低甲基化位点是各种肿瘤细胞中染色体最不稳定的区域之一,低甲基化导致在大多数HCC细胞系和HCC临床组织中这些miRNAs高度表达。miR-429和miR-200b拥有相同的种子序列,而且在对靶基因RBBP4和肝脏T-ICs的调节中起协同作用。因为miR-200a功能缺失、细胞内miR-200b分泌速率低,研究人员推测在肝脏T-ICs的miR-200b、miR-200a和miR-429基因簇中MIR-429可能是最有效的调控子。

总之,低甲基化的miR-200b、miR-200a和miR-429基因簇在EPCAM+肝脏T-ICs和非常早期的HCC样本中存在。通过体内和体外实验证明,miR-429直接标定RBBP4对肝脏T-ICs的性质产生了最引人注目的影响,进一步促进了E2F1的转录活性和OCT4基因的表达。鉴于OCT4和SOX233之间存在相互作用,SOX2对MIR-429的转录存在潜在影响,推测可能有一个正反馈回路操纵肝脏T-ICs的性质。

参考文献:

Epigenetic modification of MiR-429 promotes liver tumour-initiating cell properties by targeting Rb binding protein 4. Li L,et al.Gut-BMJ.2014 Feb.

作者简介:

王红阳:中国工程院院士,上海第二军医大学附属肝胆管外科研究所国际信号转导项目研究员、上海国家肝癌中心研究员。现任全国政协委员、第二军医大学东方肝胆外科医院信号转导研究中心主任,文职少将军衔。

陈磊:上海第二军医大学附属肝胆管外科研究所国际信号转导项目研究员、上海国家肝癌中心研究员。清华973国家重点基础研究发展计划项目《基于新一代测序的生物信息学理论与方法》第四课题组学术骨干。