MUC15抑制EGFR(表皮生长因子受体)的二聚作用并和阻止PI3K–AKT发出信号

MUC15的异常表达与大肠腺癌的发生相关,并且可以预防人类胎盘滋养层入侵,但对MUC15HCC(肝细胞癌)发病机理中所发挥的作用知之甚少。上海东方肝胆外科医院肝胆外科王若愚医师、解放军第二军医大学上海东方肝胆医院陈磊研究员带领研究人员发现MUC15抑制EGFR(表皮生长因子受体)的二聚作用和阻止PI3KAKT发出信号,伴随着MUC15水平减少的肿瘤比MUC15低水平的肿瘤更可能有侵略性特征。该成果发表在201312月的《GASTROENTEROLOGY》杂志上。

方法:

病人和样本:

用随机选择的在20061月至20099月间在上海进行肝切除术治疗的313名病人进行组织微阵列构建和分析。

统计学分析:

SAS9.1.3软件。用双尾测验或X2分析来分析变量之间具有统计学意义的差异,用配对的Wilcoxon符号秩检验或Spearman等级相关检验分析定量变量。用Kaplan-Meier法来进行生存分析。用时序检验法来进行病人亚组之间的生存比较。用分段的Cox多元风险回归模型来执行多元分析。对于MUC15p-ATK的染色密度分析,界定亚组cut-off值为中位数。样本一组由MUC15/p-AKT表达水平在中位数值之上的样品组成,另一组由剩下的样品组成。每个数据集被分开分析。

结果

在人类肝细胞癌组织和侵入性肝细胞癌细胞线中MUC15频繁减少的表达水平

用实时定量PCR法检查90对人类HCC样本中的MUC15 mRNA的表达水平,发现对于82.2%HCC样品来说,与邻近的非肿瘤肝脏组织相比MUC15的表达被显著抑制(图 1A)。免疫印迹检测的结果相似(图1B)。接下来用包含313HCC样本的HCC组织微阵列来完成MUC15表达的免疫组化(IHC)分析。癌周组MUC15蛋白质的染色密度比癌症组的大(图 1C)。典型的免疫组化染色结果(图1D)。比较了MUC15在每个病人的门静脉肿瘤血栓,肿瘤和癌旁组织中的表达水平,MUC15mRNA和蛋白质水平显著低于门静脉肿瘤血栓组织,表明MUC15HCC进程中起着保护的作用(图 1E和 1F)。

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MUC15低于正常表达水平预示着HCC病人的侵略性临床病理学特征和不良预后

基于MUC15的总体表达水平,313HCC病人被分为两组:高的MUC15表达水平组(n=157)和低的MUC15表达水平组(n=156),在HCC组织中MUC15低于正常表达水平与几个侵略性临床病理学特征显著相关(图 2A)。在一些组织的微阵列点中发现了微血管入侵和微卫星囊肿,并且与配对的肿瘤和癌旁组织相比这些区域的MUC15着色较弱(图 2B)。MUC15表达水平较低的病人表现出更差的总体存活时间和更短的复发时间(图 2CD)。多元分析进一步表明MUC15表达水平,血管入侵,病理学微卫星和乙型肝炎病毒DNA水平对HCC病人的存活时间和复发时间来说是独立的风险因素(图2EF)。较低MUC15表达水平组显示了更高的肿瘤复发风险和较短的存活时间。这些数据表明MUC15的表达水平可以作为一个独立的因素来预测HCC预后。

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MUC15的外源性表达抑制HCC细胞在体外和体内的转移和局部增长

MUC15在癌症转移中发挥着消极的作用。研究人员用慢病毒系统(SMMC7721-MUC15HCCLM3-MUC15)建立有着内源性MUC15低表达水平的人类HCC细胞系(SMMC-7721HCC-LM3)的稳定表达。对这些MUC15-表达细胞系进行抓伤伤口愈合,迁移和基底膜基质入侵试验,结果表明与慢病毒绿色荧光蛋白(GFP)相比,MUC15的外源性表达显著减少了细胞流动性(图 3A-C)。执行细胞纤连蛋白粘附试验发现,在SMMC-7721HCC-LM3细胞中MUC15的强制表达显著地抑制细胞粘附(图 3D)。为了核实MUC15超表达体内试验的结果,研究人员向裸鼠的侧尾静脉注入HCCLM3-MUC15HCCLM3-GFP细胞来评估肺部中的转移瘤的增长和老鼠的存活时间。十周后,老鼠肺部沾染上H&E,肺部的微小转移灶用显微镜观察(图 3E左)。与参照组相比,在被注入HCCLM3-MUC15细胞的老鼠体内较少和较小的转移灶被检测到(图 3E中)。此外,注射了HCCLM3-MUC15细胞的老鼠有着明显更高的存活率(图 3E右)。

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基质金属蛋白酶2MMP2),基质金属蛋白酶7MMP7)和金属蛋白酶2的组织抑制剂通过阻塞PI3K-AKT信号进行MUC15的调控表达

为探索MUC15作为中介在HCC转移中减少的潜在分子机制,研究人员首先评估MUC15是否涉及上皮-间质的转变(EMT)。对于MUC15感应,没有发现EMT相关的细胞形态学改变,表明MUC15中介细胞转移是EMT独立的。在指定的细胞溶解产物中用免疫印迹法分析MMP2,MMP7, MMP9, TIMP1,TIMP2的表达水平(图 4A)。在指定的细胞溶解产物中用免疫印迹法分析AKT (p-AKT), ERK1/2(p-ERK1/2), c-Jun-N-terminal kinase (p-JNK), p38 (pp38)的总体表达水平和磷酸化水平(图 4B)。此外,SMMC7721细胞被全长MUC15质粒(pcDNA3.1-MUC15)或pmyr-AKT暂时性转染,研究人员发现在MUC15超表达细胞中AKT的异常表达显著地修复了细胞的迁移和入侵(图 4C)。MMP2MMP7增长的MRNA水平和TIMP2下降的表达水平(图 4D)。激酶活性试验和免疫印迹法进一步表明是PI3K而不是磷酸酶和张立蛋白同系物在10号染色体上被删除(图 4E)。

图 4

MUC15EGFR之间的相互作用对MUC15调控P13K-AKT信号失活是不可缺少的

与对应的参照细胞相比,MUC15通过在HCCLM3-MUC15SMMC7721-MUC15细胞的上皮生长因子(EGF)强劲的抑制AKT活化(图 4F)。指定的细胞株暴露于EGF 05分钟,用指定抗体的免疫印迹法分析,三种EGFR中的残留物(TYR992, TYR1045和 TYR1068)的磷酸化水平在强制MUC15表达后显著减少(图5A)。指定的细胞用AG1478400 nmol/L)预先处理6小时,暴露于EFG 5分钟;结果完全阻塞了在EGFR和AKT磷酸化上高MUC15表达的效果(图5B)。

MUC15促进EGFR内化泛素化和降解

指定细胞用EFG刺激 05,1530 分钟并且在冰上培养30分钟,HCCLM3-MUC15比参照细胞表现出更快的EFGR内化(图5C 上)。交联实验显示MUC15抑制EGF刺激的EGFR二聚(图5C下)。在细胞中进行共免疫沉淀实验,MUC15-GFP与抗EGFR发生了沉淀反应(图 5D上)。内生EGFR也与一种抗EGFR标记的抗体发生了沉淀反应(图 5D 下)。进行免疫荧光试验,在细胞质中黄色点的数量逐渐增长(图 5E)。检测经EGF刺激的EGFR的蛋白质水平,由于环己酰亚胺(一种蛋白质的抑制剂)的存在,MUC15的超表达显著加强了EGFR的泛素化和降解(图6AB)。

图 5

图 6

异常的CpG 甲基化减少MUC15的表达水平

经过5-aza-CdR处理的HCC细胞株(HCC-LM3SMMC-7721)伴随着低的MUC15表达水平导致提高的MUC15 MRNA和蛋白质水平表明DNA甲基化和MUC15表达反向相关。研究人员评估十对HCC样品8CpG位点的甲基化状态,用MassARRAY-based定量甲基化分析,结果表明在与配对的非肿瘤组织,肿瘤中MUC15上游的CpG岛高度甲基化。合并的MUC15p-AKT表达水平与他们单独相比提供了改善的预后价值(图 7D)。在HCC样品中与正常肝脏组织相比较高甲基化状态的6个区域被进一步验证(图 7E)。

图 7

参考文献:

MUC15 Inhibits Dimerization of EGFR and PI3KAKT Signaling and Is Associated W ith Aggressive Hepatocellular Carcinomas in Patients.RuoYu Wang,et al. Gastroenterology. 2013 Dec

作者简介:

王若愚:上海东方肝胆外科医院肝胆外科主治医师,专业技术10级,从医10余年,擅长肝胆外科疾病的诊治。

陈磊:上海第二军医大学附属肝胆管外科研究所国际信号转导项目研究员、上海国家肝癌中心研究员。清华973国家重点基础研究发展计划项目《基于新一代测序的生物信息学理论与方法》第四课题组学术骨干。