miR-20a引发胆囊癌转移

解放军第二军医大学上海东方肝胆医院王红阳院士带领研究人员构建出一种基于高内涵技术(HCS)的miRNA文库筛选方法,首次从miRNA文库中筛选出与胆囊癌细胞增殖与迁移有关的miRNA,并阐明了所筛选的miRNA参与调控胆囊癌细胞增殖与迁移的机制。相关研究论文已发表于20139月《Journal of Hepatology》。

胆囊癌(GBC)是全球第七的胃肠道肿瘤,每年的发病率超过10000人,死亡约3300人。胆囊癌的预后非常差,局部复发率极高。所有其他治疗,包括化疗和放疗是暂时性的,并导致无显着改善预后和生存率。在胆囊癌患者的局部肿瘤中,影响预后的主要因素是肝浸润和淋巴结转移。许多miRNAs已经证明参与肿瘤的发生发展作为致癌基因或抑癌基因。miR-20a位于13q31染色体区域和一些癌症的预后不良相关。最近,它已被证明由miR-17-92基因簇编码,增强卵巢癌细胞和骨肉瘤细胞的增殖和转移,miR-20a表达有助于结直肠腺癌的化疗耐药。相比之下,miR-20a表达抑制乳腺癌和胰腺癌增殖和转移。在miR-17-92基因簇,有许多miRNAs被证明是致癌基因。然而,在这项研究中miR-20a是具有很大可能会促转移胆囊癌。在这里,研究人员首先表明,miR-20a在胆囊癌标本中表达上调,从而促进浸润与胆囊癌细胞的增殖,伴随着几个在体外和体内的EMT相关基因失调。Smad7作为潜在的TGF-β信号通路抑制剂,被确定为miR-20a的靶标。

研究人员设计一个新的功能获得型miRNA的筛选技术过滤掉在胆囊癌促转移的miRNA。他们在胆囊癌组织中的表达通过实时定量荧光PCR被证实。通过免疫印迹、免疫组化实验,原位杂交检测深入研究了miRNA的生物学功能。在小鼠移植瘤模型进一步研究肿瘤和肝转移。

该课题组研究者在王红阳教授带领下,利用HCS技术,通过检测文库中不同miRNAF-肌动蛋白网络的影响(流程图如上),从一个包含880miRNA的文库中快速筛选出17个能够促进转移的miRNA。其中数个已先后在体内和体外的实验中被证实是肿瘤转移的关键因子,结合临床样品qRT-PCR分析,预测miR-20a在胆囊癌恶性进展中发挥着重要作用。

为了探讨胆囊癌细胞miR-20a的潜在作用,研究人员首先应用成熟miR-20a Mimics和特异性抑制剂miR- 20A antagomir。如fig2a所示,随着miR-20a外源表达细胞系表现出细胞间的接触减少和更细长的形态。同时,随着miR-20a antagomir治疗导致明显的梭形、多角细胞粘附在细胞与对照比较的形成。研究人员还应用慢病毒表达系统表达并检测miR - 20A GFPmiR-NC GFP产生的四个稳定的胆囊癌细胞系 GBC-SD, and SGC-996。正如预期的那样,GBC-SD-20a细胞表现出相似的形态,像miR20a瞬时转染。

此外,“'wound healing”和Boyden chamber检测显示在胆囊癌迁移和侵袭活性增强,这表明miR-20a可以显著促进体外培养的癌细胞转移。(fig.2b-d)。相应地,Western blot和实时荧光定量PCR分析表明,E-cadherin减少时,miR-20a显著增加了EMT相关基因的表达,N-cadherin, Vimentinsnaifig.2e)如fig.2f所示,在miR-20a antagomir的存在下显著抑制肿瘤生长。免疫组织化学染色显示E-cadherin的膜定位,miR-20a antagomir接种肿瘤组织中波形蛋白低表达,Ki-67阳性细胞较少(fig.2g)。E-cadherinN-cadherin mRNA表达,波形蛋白也表现出类似的趋势。接着,研究人员采用肝肿瘤转移模型通过脾脏注射到体内的胆囊癌细胞的转移能力监测。随着和miR-20a antagomir治疗的小鼠相比,总转移发生数极显著高于对照组(fig.2h)。特异性抗体CA19-9IHC证明存在肿瘤转移(fig.2h)。

 

 

在功能性验证过程中,使用软件预测与实验验证,在体内及体外环境发现了miR-20aSmad7的负向调节作用,证明Smad7就是miR-20a的靶基因。Smad7在胚胎发育和成人体内平衡过程中起到重要作用,该基因表达改变常与人类疾病有关,研究者在体外环境实验中通过siRNA沉默发现Smad7可阻碍β-catenin核转运,特异性地减弱GBC细胞的增殖、转移与侵袭,首次发现了Smad7/β-catenin通路对于预后的关键作用。

 

 

此后,研究者在体外环境中使用miRNA antagomir下调miR-20a表达量,发现由此而产生的Smad7表达上调可显著地阻止由TGF-β1诱导的GBCEMT现象,进而减弱GBC细胞迁移与侵袭。这一结果证明miR-20a/Smad7/β-catenin路线在由TGF-β1所诱导的细胞迁移过程中起到了很重要的作用,它们为胆囊癌早期诊断以及新的治疗方案提供了有效的靶点。

 

880miRNA17被过滤出来作为胆囊癌转移的突出物。其中,随访的67个胆囊癌患者中发现促转移miR-20a上调与临床上局部浸润、远处转移、不良预后密切相关。miR-20a高表达的患者比低表达组表现出较差的生存期。在胆囊癌患者中发现显着增加TGF-β1水平,它是负责miR-20a上调。研究者发现患者体内TGF-β1大幅度的增加,而TGF-β1的增加导致miR-20a表达量的升高,这种miR-20a的异常表达能诱发上皮细胞间质转移和增加GBC细胞的转移。这一研究表明TGF-β1激活miR-20a/Smad7/β-catenin机制,调控着GBC的病发及恶化。因此miR-20a的表达在GBC转移过程中扮演着至关重要的角色,miR-20a有望为癌症的治疗提供新的靶点。

参考文献:

miR-20a triggers metastasis of gallbladder carcinoma.Yanxin Chang, et al.Journal of Hepatology.2013 Sep

作者简介:

王红阳:中国工程院院士,上海第二军医大学附属肝胆管外科研究所国际信号转导项目研究员、上海国家肝癌中心研究员。现任全国政协委员、第二军医大学东方肝胆外科医院信号转导研究中心主任,文职少将军衔。

陈磊:上海第二军医大学附属肝胆管外科研究所国际信号转导项目研究员、上海国家肝癌中心研究员。清华973国家重点基础研究发展计划项目《基于新一代测序的生物信息学理论与方法》第四课题组学术骨干。