近年来，随着精准医疗的发展，癌症治疗已经取得了长足的进步，其中借助免疫系统开发的多种治疗方法被人们寄予厚望。虽然部分治疗方法在临床治疗中已经获得一定的成功，但大多数只对部分患者有效，并且还会导致耐药、超进展以及免疫相关严重不良反应等问题。因此，了解免疫系统在癌症治疗中的表现，准确筛选最有可能获益的患者人群，已成为当前癌症治疗实践中的一项重大挑战。

澳大利亚加文医学研究所的科学家开发了一种新的单细胞测序方法RAGE-Seq（Repertoire and Gene Expression by Sequencing），该方法兼备高通量、靶向、长读长和单细胞测序特征，能够高准确度和灵敏度的识别全长抗原受体序列，追踪与癌症免疫反应相关的免疫细胞。7月16日，相关研究成果发表在Nature Communications上，文章为“High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes”。

癌症由人体自身细胞发展而来，可以产生有效抗癌免疫反应的免疫细胞通常很少，因此，人体免疫系统往往对癌症的反应效果不佳。免疫系统中的T淋巴细胞和B淋巴细胞在其表面上表达不同的受体，分别是B细胞受体BCR，T细胞受体TCR。当T细胞或B细胞被抗原刺激分裂并进行克隆扩增时，BCR或TCR序列将作为独特的“克隆条形码”，并可提供有关抗原特异性和细胞起源信息。

对单个淋巴细胞的BCRs和TCRs与其转录组进行并行测序，可以帮助科学家了解免疫系统是如何对癌症、自体免疫反应等疾病作出反应的。虽然有相关方法可以在单细胞水平上读取编码T细胞和B细胞受体的RNA，但现有技术仍不能在单次运行中对肿瘤中的数千个细胞进行分类。

加文医学研究所肿瘤进展实验室负责人Alex Swarbrk博士指出：“能够识别癌细胞的免疫细胞通常是罕见的。我们必须对成千上万的免疫细胞进行分类，找到那些只占肿瘤免疫细胞一小部分的细胞。”将抗原受体序列与单个淋巴细胞的基因表达谱连接起来，有助于进行细胞分类，目前常用的一种方法是单细胞全长RNA测序方法Smart-Seq2。但该方法依赖于平板或良好的微流控技术，因此可以分析的细胞数量有限，通常只有10~100s。长读长测序技术的最新进展可以弥补短读长测序的不足，实现完整BCR和TCR转录组的测序。但长读长测序比短读长测序技术具有更高的错误率和更低的测序深度。

为解决以上问题，加文医学研究所的科学家将来自Oxford Nanopore Technologies、10X Genomics、Illumina和CaptureSeq的靶向捕获富集、长读长测序、短读长转录组分析和单细胞测序等技术结合，开发出RAGE-Seq方法。

图：RAGE-Seq概述

首先，研究人员开发了一种新的单细胞RNA富集方法，可以靶向富集编码免疫细胞受体的RNA。同时，他们还开发了一种能够准确读取免疫细胞抗原受体完整序列的计算工具。值得注意的是，RAGE-Seq技术可用于高通量的基于液滴的scRNA-Seq工作流程，可准确地将基因表达谱与来自大量细胞的靶向全长mRNA序列进行配对。

RAGE-Seq的这种工作方式类似于条形码追踪器，通过扫描数千个细胞中的免疫细胞受体，为研究人员提供组织样本中免疫细胞相互关联的准确信息，并有助于分析哪种细胞可能对癌症产生有效反应。此外，该方法不需要流式细胞仪也能进行特定淋巴细胞的分离，因此可用于组织中低丰度淋巴细胞的回顾性表征。

为了验证该方法，研究团队对来自三阴性乳腺癌患者肿瘤和淋巴结的7,138个细胞样本进行了RAGE-Seq，以追踪扩增淋巴细胞克隆的转录组谱，识别那些对癌症产生有效反应的免疫细胞。研究结果显示，RAGE-Seq能够有效识别肿瘤和淋巴结组织中的免疫细胞，证明了RAGE-Seq检测人体组织中体细胞超突变的能力，并发现患者肿瘤的免疫反应具有独特的遗传特征和组织特异性富集。

RAGE-Seq是一种追踪大量淋巴细胞克隆进化的有效方法，适用于免疫、自身免疫和癌症研究。该研究团队开发的通用实验工作流程和计算流程，可以将单细胞基因表达与全长mRNA转录组的靶向表征相结合。研究结果显示，RAGE-Seq在Illumina和Nanopore测序平台上的检测能力非常强，并且对永生化（immortalized）和原代人B细胞和T细胞全长BCR和TCR序列具有高度敏感性和准确性。与其他免疫分析方法相比，RANG-Seq具有更高的通量和更低的成本。

研究人员表示：“RAGE-Seq的一个重要应用是能够追踪组织中克隆相关的T或B细胞，对免疫系统进化进行系统性观察。另一个重要应用就是分析肿瘤中的淋巴细胞及其引流淋巴结，抗原表达的假定部位和肿瘤浸润淋巴细胞的来源。”在肿瘤组织中识别罕见免疫系统细胞有助于指导个性化治疗。此外，更好地了解免疫系统如何对癌症做出反应，有助于相关抗癌药物和治疗方法的研发。

免疫细胞在疾病的发生发展中起关键作用。RAGE-Seq的高准确度和单碱基精度特别适用于癌症体细胞突变的鉴定，为我们提供关于免疫细胞在人体中如何表现的最详细的视角，在癌症个性化治疗方面有巨大的潜力。此外，RAGE-Seq在多种RNA测序平台上的适应性和针对一系列基因的灵活性为先进的单细胞分析提供了新的基因组工具包。希望RAGE-seq能够尽快在临床试验中实施，为帮助癌症患者更快更准确地找到潜在的治疗方法提供关键信息。

虽然目前发表的研究成果主要集中在抗原受体序列上，但研究人员指出，任何目标转录组都可以使用改进的RAGE-seq进行定位。据悉，研究团队正利用RANG-Seq对黑色素瘤患者的样本进行分析，以获得这种癌症对免疫治疗反应如此差的新见解。

参考资料：

1.High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes.

2.Anticancer Immune Cells Identified Using Antigen Receptor Barcode Tracker.