编者按：近年来，随着“精准医学”理念的不断拓展，针对癌症的液体活检开展得异常火热。目前，癌症的液体活检手段主要包括循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环RNA（cfRNA）、外泌体以及蛋白和代谢产物检测等。其中，针对ctDNA的体细胞突变检测技术研究及应用较为广泛。但该技术也存在一定的局限性，如癌细胞释放的ctDNA多数未发生突变，或者发生了罕见突变难以识别，为检测的准确性和精确性带来了极大的挑战。但这并不能阻挡投资者对液体活检研究的投资热情。近日，Nature Biotechnology发表了评论文章，探讨了投资者们对癌症液体活检热情高涨背后的原因。测序中国对该文章进行了整理，以下为文章报道全文。

2019年7月，Adaptive Biotechnologies公司完成了高达3.45亿美元的首次公开募股（IPO）。在同一个月，Freenome筹集了1.6亿美元的B轮资金。5月，Thrive Earlier Detection公司完成1.1亿美元A轮融资。

液体活检的前提是寻找到有“意义”的微量ctDNA，其在癌症诊断方面的有效性已被大量研究所证明。目前，拥有商业化产品的液体活检公司（如Adaptive、Guardant Health），以及众多学术研究人员，都在试图通过简单的血液检测以用来评估肿瘤大小、用药指导、监测治疗耐药性，监测疾病复发和预后。但截止到目前，液体活检在临床实践中的应用程度仍然很低。同时，液体活检的信噪比问题将使基于人群的癌症筛查变得更加复杂。

尽管ctDNA仅占血液cfDNA总量的一小部分，但其在癌症早期筛查中的应用前景依然很诱人。因为更早接受癌症诊断的患者与较晚接受诊断的患者在治疗结果上一直存在很大差距。英国伦敦帝国学院癌症医学和肿瘤学教授Justin Stebbing表示：“大多数癌症是可以通过早期发现并治愈的。”

ctDNA存在于癌症患者血液中的事实在几十年前就被确认，得益于近些年NGS技术的快速发展，才使其成为一种潜在的癌症诊断分析手段。基于NGS的液体活检技术能否在临床诊断中提供足够的敏感度和特异性，以及能否正确识别癌症患者仍有待深入研究。此外，对于癌症患者，即使是晚期患者，液体活检仍是少数人的选择。Stebbing教授认为：“这仍是一项正在进行的大规模研究工作。对绝大多数患者来说，液体活检还没有被纳入临床实践。”

有关液体活检用于早期癌症筛查的第一批前瞻性研究正在进行中，研究针对平均风险和高风险人群，而不是已经确诊的癌症患者。但相关研究数据仍需要几年时间才能充分“成熟”，进而正确评估液体活检的临床实用性。与此同时，该领域的一些领先公司也在打磨产品时继续解决部分关键问题，例如寻找哪些生物信号？如何解读检测结果？应该关注哪些指标？随着液体活检市场竞争的升温，各大公司试图通过自己的研究数据提高竞争力（表1）。

表1.国外癌症液体活检试验

Grail：关注DNA甲基化特征

2016年1月，测序巨头Illumina公司宣布成立Grail公司，致力于开发基于血液的癌症早期检测方法。Grail在成立之初，便通过Illumina、比尔·盖茨、杰夫·贝索斯的私人投资公司Bezos Expeditions和Arch Venture Partners公司募集了超过1亿美元的A轮融资。时隔一年，Grail公司又宣称将获得10亿美元的B轮融资。该公司基本放弃了寻找与癌症相关的ctDNA突变，而是研究ctDNA的甲基化特征。Grail联合创始人兼首席科学官Alex Aravanis表示，近期研究发现，即使非恶性造血细胞也能积累克隆突变，这使得cfDNA的基因分型解释更加复杂化。尽管如此，他仍坚信，与癌症相关突变相比，cfDNA的甲基化特征能够提供更加丰富的信息。“对于被检测基因组中的某个特定区域，DNA通常只包含2~3个突变。但在基因组的同一片段中，你可能会发现成百上千的甲基化变化。”

目前，Grail的癌症和非癌症甲基化特征测序数据库覆盖了基因组中大约3000万个甲基化位点。除了表明是否存在癌症，甲基化标记还能溯源癌症的发生组织，这对后期的临床随访非常重要。

在2019年夏季举行的美国临床肿瘤学会会议上，Grail及其临床合作者报告了最新试验数据。据报告称，Grail多癌种原型血液检测方法能够在癌症早期阶段检测到12种致命癌症类型的强烈信号，检出率为59%~86%，特异性达到99%。Aravanis表示：“我们认为这不仅仅是为临床有意义的液体活检技术扫清了障碍。我们准备将把这种检测技术运用到诊所。”据悉，Grail公司计划在2020年开始一项前瞻性研究，测试其液体活检泛癌诊断方法，并且参与者将第一次收到自己的检测结果，如有必要，将对参与者采取干预措施。

Thrive：将癌症早筛纳入日常护理

成立不久的Thrive Earlier Detection公司同样关注泛癌研究。Thrip首席执行官Steven Kafka表示：“我们的最终目标是将癌症早期检测纳入所谓的‘一般风险人群’的日常护理中。液体活检技术需要并且可以成为一种多癌症检测方法。”目前，Thrive公司正在开发一个基于CancerSEEK的液体活检平台。CancerSeek是由约翰霍普金斯大学的研究人开发的一种原型测试，该平台能够识别1,933个不同基因位点的突变，以及一组经验证的癌症蛋白质生物标志物。

投资者们对液体活检的热情或许还可以用CancerSeek的早期研究结果来解释。在一项针对1,005例确诊非转移癌（Ⅰ-Ⅲ期）患者的回顾性研究中，CancerSeek在5种癌症（卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌和食管癌）中检出率为69%~98%（特异性>99%）。通过一种机器学习算法可以将平均83%的患者肿瘤定位到两个解剖点，并且可将63%的患者肿瘤定位到单个器官。CancerSeek对I期癌、II期癌和III期癌的中位敏感性分别为43%、73%和78%。在没有对大多数癌症类型进行筛查的情况下，这种敏感性水平可能比现在更早地发现癌症。Kafka表示：“‘更早发现’比‘早发现’更重要，这不仅仅是在第一阶段发现癌症。如果我们能做到这一点，那就太好了。”

Thrive公司目前正在与约翰斯霍普金斯大学和医疗服务提供商Geisinger 合作，以进行一项为期五年的前瞻性筛查研究。该研究已经招收了10,000名65~75岁的健康女性参与者，预计将在2020年年中公布部分研究数据。

Freenome：广泛“撒网”

在寻找癌症早期迹象方面，Freenome公司比竞争对手进行了更广泛地“撒网”。Freenome的“多组合”方法可检测来自新生肿瘤和免疫系统的cfDNA、甲基化特征和蛋白质。然后利用人工智能驱动的分析方法对这些信号进行集成分析。Freenome检测方法的基础是免疫系统的CTC在癌症早期阶段就开始产生应答反应。“很多其他公司忽略了这一点，大部分液体活检研究只针对肿瘤脱落的ctDNA部分。他们忽略了占99%以上的cfDNA。”Freenome首席科学馆Jimmy Lin表示。

在已报道的一项回顾性研究中，Freenome检测来自Ⅰ期和Ⅱ期结直肠癌细胞和免疫细胞cfDNA的平均灵敏度为85%，特异性为85%。“我们相信可以超越这一点，”Freenome联合创始人兼首席合伙人Charles Roberts表示。

多伦多西奈山医院和大学卫生网络的临床生物化学主管Eeftherios Diamandis表示，这种多组合方法是“有效的”。但他同时警告说：“增加检测分析样本的数量，可增加敏感性，也可检测到更多的癌症，但同时也可能降低特异性。”对此，Freenome的Jimmy Lin反驳到，利用其专有的机器学习方法解释检测数据可以避免这个问题。

据悉，Freenome正在采取逐步发展其平台的方法，最初的研究重点是结直肠癌。虽然结直肠癌已经有一个明确的筛查产品——Exact Sciences的粪便DNA检测，但 Freenome旨在自己进行检测。目前，Freenome正进行一项名为AI-Emerge的试验研究。该研究涉及3,400名参与者，包括接受常规结肠镜检查的健康志愿者和新诊断的结直肠癌患者，研究将于2020年年初公布。

Guardant Health：癌症早筛领先者

事实上，Freenome并不是唯一关注结直肠癌领域的公司。Guardant Health公司是进行液体活检癌症早筛的领先者，并且开发了一种结直肠癌早期检测方法Lunar-2。Lunar-2结合了ctDNA测序和表观基因组分析，以及消除造血过程中产生的良性克隆突变的生物信息学分类系统。Guardant联合创始人、总裁兼首席运营官Amirali Talasaz说：“2019年下半年，我们将开始对结直肠癌进行关键的前瞻性筛查研究。该研究将招募10,000名有结直肠癌平均风险的参与者。”

到目前为止，以人群为基础的癌症筛查仍是偶然事件。CT检查、结肠镜检查、巴氏试验和乳房X线检查分别在减少肺癌、结直肠癌、宫颈癌和乳腺癌的死亡率方面表现出了不同程度的益处，但这些筛查方法仍存在一些缺陷。此外，许多其他类型的癌症还没有有效的筛查手段，例如胰腺癌和肝癌。因此，液体活检技术的研发人员有足够的发展空间为癌症筛查带来一种全新的方法。但与开发一种精确的检测方法一样，了解检测结果的临床意义也非常重要。

“我们已经知道及早发现癌症是可行的，”英国inivata公司联合创始人兼首席科学官Nitzan Rosenfeld表示。他指出：“在基于cfDNA的非侵入性产前检测中，孕妇被发现存在染色体数目异常。最困难的是这种检测手段能否在临床上应用。”此外，相关检测技术在癌症诊断和治疗中还要注意解决过度诊断、过度治疗以及诊断不足等问题。

测序中国编者后记

同样是液体活检技术，为何癌症检测比NIPT要难？

实际上，癌症患者血液中ctDNA的发现要早于妊娠妇女血液中胎儿DNA（cffDNA）的发现。目前，基于液体活检技术进行胎儿非整倍体检测，也就是非侵入性产前检测（non-invasive prenatal testing，NIPT）已经相对标准化和流程化，且具有高特异性和灵敏度。相比之下，对癌症患者进行基因检测的液体活检技术在临床实践过程中却困难重重，是何原因？

凭借目前的NIPT技术，母体血浆中cffDNA含量若低于4%容易导致假阴性结果。而一般情况，从妊娠第9周开始，母体血浆中的胎儿DNA占比已经较高，大约为10%。与之相比，癌症的发生是一种极为复杂的、异质性变化的、动态发展的过程，并且涉及多种基因-环境的相互作用。不同肿瘤亚群、不同疾病分期或肿瘤负荷、微环境，以及多种未知ctDNA的释放等因素都会对肿瘤的基因检测结果造成影响。即便处于相同疾病阶段的癌症患者，ctDNA的含量也各不相同，并且常低于4%。因此，ctDNA的分析更难实现标准化，特别是用于癌症早期筛查阶段。

基于液体活检的癌症早筛，在中国已吹响了冲锋的号角！

如今，精准医学已进入第五个年头，以高通量测序技术为助力的“精准医学”在解决临床问题的同时，也带动了一个百亿美元的伴随诊断产业发展。与此同时，一个规模远超伴随诊断的“精准医疗”细分市场也在迅速成长，并以排山倒海之势走进我们的视野。相比“拥挤”的癌症个体化治疗领域，癌症早筛早诊基因检测领域仍可谓一片蓝海，发展前景广阔，留给创业者和投资人很大的想象空间。如上所述，2016年成立的Grail公司以癌症早筛早诊基因检测为切入点，已然成为癌症早筛领域的“独角兽”。

近年来，中国癌症早筛早诊基因检测行业也吹响了冲锋的号角。由张鹍教授与高远教授联合创立的鹍远基因已拥有了国际领先的癌症早筛无创甲基化技术。同时，由香港中文大学卢煜明教授联合创立的Take2 Health公司已获得Grail的授权开发早期鼻咽癌检测技术；由范建兵博士创立的基准医疗公司也已开发了针对肺部结节良恶性检测以及基于尿液DNA甲基化的膀胱癌检测产品；位于深圳的思勤医疗公司在2018年发布了世界首款泛癌种早期筛查产品，以分析外周血游离 DNA 片段中癌症基因突变为核心，采用全新多变量算法结合大数据和人工智能判断癌症，并能实现对癌症受累器官的溯源。此外，中科普瑞公司基于甲基化捕获测序的肺癌早期诊断产品、泛生子公司基于cfDNA和蛋白标志物所开发的肝癌早筛产品，以及莱盟君泰公司基于ctDNA甲基化所开发的肝癌、鼻咽癌等癌症早期诊断产品均已取得了国际领先的技术成果。但仍需注意的是，高通量测序技术进入癌症早筛早诊领域并不久，如何快速开发突破性技术、精准寻找临床切入点，构建完整的产业链并创造可供企业成长的环境，是考量企业长期发展潜力的重要指标。我们相信未来3~5年，将有大批科学家、创业者以及临床工作者继续投身于此。在资本的助力下，更多产品也将陆续面世，基于液体活检的癌症早筛领域必将推动精准医学迈向一个新时代。

1.Investors keep the faith in cancer liquid biopsies

https://www.nature.com/articles/d41587-019-00022-7

2.《2019 DNA甲基化与癌症早筛专题报告》, 测序中国。