结肠直肠癌（CRC）是全球诊断率排名第三的消化道恶性肿瘤。2018年，约有881,000人死于CRC。据统计，超过70％的CRC位于结肠，也就是结肠癌（CC）。CC在北美、欧洲和澳大利亚等地区的发病率和死亡率非常高。近年来，亚洲国家CC的发病率也逐年递增，CC的诊断和治疗已成为全球关注的热点问题。

早期CC患者可以通过手术等手段得到治疗，5年生存率已超过90%，但晚期CC患者的中位生存期不到2年。显然，CC的早期诊断有利于提高患者的生存率，改善临床治疗结果。但到目前为止，除了内窥镜检查，几乎没有其他任何方法可用于CC的早期诊断。大多数CC筛查仅根据参与者的年龄、性别以及其他流行病学因素进行初步诊断，导致筛查的依从性低和医疗资源大量浪费。因此，临床迫切需要一种侵入性小且易操作的CC早期诊断替代方法。

目前，液体活检已经成为癌症早期诊断的重要研究方向。miRNAs能够通过转录后调节来控制基因表达，在胚胎发育、癌症发生、免疫调节和其他生物过程中起着至关重要的作用。已有研究表明，血浆、血清和尿液中的循环miRNA有作为癌症和其他疾病的无创生物标志物的潜力。

循环miRNA来源于癌细胞、成纤维细胞、凋亡细胞甚至坏死细胞，且具有高度异质性。但目前对循环miRNA的生物学功能仍知之甚少，这在很大程度上限制了其作为生物标志物的应用潜力。miRNA的另一个重要来源是外泌体——小细胞外囊泡（sEV）。sEV的膜可以有效地保护内部miRNA免受RNase的影响，从而使得sEVs衍生的miRNA比血液等体液中的循环miRNA更可靠。多项研究显示，小细胞外囊泡（sEV）在多种疾病的早期检测中有着重要作用，但对于sEV衍生miRNA作为早期CC特异生物标志物的系统筛选尚未有报道。

近日，由首都医科大学附属北京友谊医院消化分中心团队与北京恩泽康泰团队合作的研究成果发表在国际外泌体顶级期刊Journal of Extracellular Vesicles（IF=11）。该研究首次报道了早期结肠癌患者血浆外泌体的miRNA图谱，开发了可高效识别早期结肠癌的外泌体液体活检方案，并发现外泌体miRNA比血浆游离miRNA更适合消化道早期癌症诊断，可以作为CC早期诊断的一种潜在生物标志物。

为对早期结肠癌的特异性血浆sEVs标志物进行系统性的筛选和验证，该研究团队以血浆sEVs-miRNAs作为早期结肠癌标志物，从miRNA特征鉴定、差异miRNAs筛选、标志物筛选及验证、标志物在早期结肠癌中的验证、诊断性能比较等方面，系统对比分析了CC患者和正常对照（NC）血浆总miRNAs。

利用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析技术（NTA）和蛋白质印迹法（WB），研究人员对来自15名CC患者和10名正常对照的sEVs进行了表征分析。初步研究结果显示，经血浆总RNA归一后，CC患者和NC的sEVs RNA浓度、血浆总RNA浓度以及sEVs RNA在百分比方面均无显著差异（图1）。

 图1. sEVs的TEM（A）、NTA（B）和WB（C）表征。

同时，研究人员还对血浆sEVs进行了miRNA测序及差异miRNA分析（图2）。结果显示，有60个差异表达miRNA（DEMs）与TCGA数据库有重叠，且每个DEM在sEVs和TCGA中有着相似的灵敏度和特异性。这60个DEMs对应的靶基因涉及细胞骨架、细胞迁移、ATP结合、生物合成等功能以及癌症相关通路。

图2. A.结肠癌种TCGA数据集和sEVs差异miRNA数据集的韦恩图；B.60个共有DEMs在sEVs中的表达量热图；C.sEVs测序数据中60个DEMs诊断CC的灵敏度和特异性分布；D. TCGA数据中60个DEMs诊断CC的灵敏度和特异性分布。

基于上述60个DEMs，研究人员从已报道的结直肠癌标志物中筛选出4个候选miRNA标志物：let-7b-3p、miR-150-3p、miR-145-3p和miR-139-3p。此外，研究人员在RNA提取前进行了蛋白酶K和RNase的消化验证（图3）。研究结果显示，4种标志物在sEVs中未降解，而在血浆中经酶消化后部分降解；阳性对照miR-21-5p和miR-30a-5p（已知的RNP相关miRNA）在相同处理下几乎完全降解，表明候选miRNAs在sEVs中受到sEVs膜的保护。

图3. 血浆和sEVs在蛋白酶K和RNase A处理后的蛋白考马斯亮蓝染色（A）和RNA的2100检测结果（B、C）以及miRNAs的RT-qPCR定量结果（D-G）。

在结肠癌早期诊断的验证试验中，研究人员利用RT-qPCR方法在134例样本（58例CC，76例NC）中验证了sEVs来源的let-7b-3p、miR-150-3p、miR-145-3p和miR-139-3p的诊断性能（图4）。研究数据显示，四个miRNA的曲线下面积（the area under the ROC curve，AUC）分别为0.792、0.686、0.692和0.679。经过进一步逻辑回归模型分析，let-7b-3p、miR-145-3p和miR-139-3p的组合AUC可高达0.927。 

图4. sEVs来源miRNA panels作为早期CC诊断标志物的AUC性能。

sEVs中的miRNA是血浆总miRNA的一部分，为研究sEVs来源miRNA作为生物标志物的必要性，该研究对比分析了sEVs来源miRNA和血浆总miRNA中候选标志物的诊断性能（图5）。结果显示，与血浆总miRNA相比，sEVs来源miRNA有着更高的AUC和诊断潜能。对比多个miRNA panels，分离后的sEVs miRNA在早期CC患者的识别、诊断中有着非常明显的优势。

图5. miRNA panels在sEVs和血浆总miRNAs中作为早期CC诊断标志物的AUC性能比较。

闵力

北京友谊医院消化分中心闵力研究员表示：“肠癌的潜伏期可长达5~20年，早期发现和摘除是目前对疾病最有效的干预方式。在美国，由于肠镜依从性好，肠癌发现时间较早，其死亡率远低于中国。而据统计，中国目前的消化道内镜医师人数不足4万人，按照每人一年开展1000例内镜检查来推算（已经接近极限），全国年检查量约合4000万人次，还不足实际人口的3%。要实现消化道癌症的早诊早治，势必要开发简洁高效的无创手段来辅助，从普通群体中识别结肠癌高危人群，建议进一步做肠镜检查及处理，使内窥镜检查更有针对性，提高筛查效率，降低医疗资源浪费。而基于血液外泌体这一液体活检新方法无疑极具潜力，此次取得阶段性成果后会继续深入合作，设计更严谨的临床方案，扩大样本队列研究开发贴近临床实践的产品。 ”

孔关义

对于该研究成果，恩泽康泰CEO孔关义表示：“首先，该研究是由国内外泌体转化企业与医院合作在国际囊泡协会专属杂志JEV上发表的首篇文章，表明恩泽康泰在外泌体转化研究层面的质量标准得到了国际囊泡协会的认可，为进一步开展更多的外泌体转化研究和临床试验工作奠定了良好的基础。其次，该研究首次在早期癌症中头对头比较了囊泡来源RNA与血浆总RNA的诊断性能，证实了囊泡来源RNA在早癌中有更好的应用前景，为外泌体（或囊泡）RNA在肿瘤早期诊断方面的临床应用建立了理论基础。”

赵立波

恩泽康泰CTO赵立波表示：“此次发表在JEV上的工作，是我们与北京友谊医院在发展非侵入式消化道癌症早诊技术上的一次重要探索。外泌体作为细胞间通讯的信息载体，携带有包括RNA在内的多种生物大分子。在本项研究中，我们和友谊医院通力合作，通过公司搭建的完善的外泌体研究平台、全流程严格的质控体系来保障项目的顺利进行。例如，我们已经开发了独创的Exosupur外泌体分离技术，能够兼顾纯度与回收效率；针对外泌体RNA表达量低、扩增偏差等情况，开发了外泌体RNA-UMI（Unique Molecular Index）建库测序技术，以便排除PCR偏倚对RNA定量的影响；开发了针对此建库技术的MBSC精确定量算法，确保绝对定量准确还原基因表达原始状态；同时也建立了一套稳定而质控严格的外泌体qPCR验证体系。将来我们会沿着这一方向，不断完善和开发新技术，持续推动基于细胞外囊泡的体外诊断技术转化。”

近年来，CC的早期诊断和治疗已成为全球关注的热点问题。该研究结果表明，sEVs来源的miRNA在结直肠癌早期诊断中具有良好的诊断性能，且优于血浆总miRNA，为结肠癌早期诊断提供了新的潜在诊断生物标志物，同时也为其他癌症的诊断治疗提供了新的研究思路。目前，包括恩泽康泰在内的众多国内外研究机构和企业积极关注外泌体研究及其临床应用，相信随着液体活检技术的飞速发展，癌症的早期诊断和治疗目标终将实现，让我们拭目以待。

参考资料：

Lin Min, Shengtao Zhu, Lei Chen, et al. Evaluation of circulating small extracellular vesicles derived miRNAs as biomarkers of early colon cancer: a comparison with plasma total miRNAs. Journal of Extracellular Vesicles. DOI.org/10.1080/20013078.2019.1643670

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/20013078.2019.1643670?scroll=top&needAccess=true