细胞外RNA（exRNA）作为一种新型液体活检标志物，因其广谱性及多样性近些年引起了科学家的广泛关注。此前研究发现，包括miRNA在内的小exRNA与某些疾病的临床治疗反应相关，但关于其他类型exRNAs的存在情况及其临床相关性研究仍十分有限。此外，血清中的exRNA经过提取步骤后，含量往往非常低，这无疑限制了研究人员对exRNA开展更为深入的研究。

为了高效分析血清exRNA，由加州大学圣地亚哥分校钟声教授领导的研究团队（联合H. Irene Su教授、钱煦教授）突破性地开发了一种名为“SILVER-seq”（Small Input Liquid Volume Extracellular RNA Sequencing）的低上样量exRNA液体活检技术，仅需单滴量级（5~7µL）的液体活检样本，便可对完整和碎片化的exRNA进行有效测序。利用SILVER-seq技术，研究人员发现，血清exRNA表达水平与供体性别和年龄之间呈现强相关性，并可通过血清exRNA对脑基因表达进行频繁监测。此外，基于exRNA表达水平的分类还能有效区分乳腺癌患者与健康对照组，并进一步帮助区分复发与非复发乳腺癌患者。以上研究成果彰显了基于单滴血清实现exRNA液体活检的巨大潜力，为开发新型疾病筛查与监测手段指明了方向，也为探索疾病发生发展开辟了新视角。相关研究成果于当地时间9月3日在线发表于国际顶级学术期刊PNAS。

图1：部分作者合影，从左到右为钟声、郑海子、严章明、周子旭。

如上所述，SILVER-seq上样量只需几微升血清，该体积小于指尖采血的血量（约30µL）。为开发SILVER-seq技术，钟声教授研究团队调整了单细胞RNA-seq的主要步骤。与其他液体活检RNA-seq方法不同，为尽量减少血清中RNA的丢失，SILVER-seq并没有从RNA提取纯化开始，而是直接向原始样本中添加试剂以进行尽可能多的生化反应。

那么SILVER-seq能否从微升级别的人体血清中稳定地构建测序文库？

为此，研究人员利用同一血清样本验证了SILVER-seq技术的可靠性，最终获得的测序文库片段大小为200~500bp（图2A），与预期文库片段范围大小一致。同时，研究人员还对8个文库进行了测序，每个文库平均产生480万个单端测序reads，其中超过80％的reads都能唯一比对到人类基因组（hg38）（图2B）。以上数据表明，SILVER-seq可以从几微升的人类血清中稳定构建测序文库。

图2. SILVER-seq构建测序文库，并与人类基因组（hg38）reads比对。图片来源：PNAS文章。

此外，基于血清样本，研究团队对比了SILVER-seq与标准RNA-seq测序方法。结果显示，经处理的5-7µL血清中exRNA的量约为10pg，与单个细胞中的RNA量相当。SILVER-seq检测exRNAs的效率比标准RNA-seq更高，有效抑制了上样量减少引起的检测变化。

在分析试验中，研究团队利用SILVER-seq技术检测了150多份血清液滴，这些样本来自年龄18~48岁的乳腺癌患者和健康捐赠者。该研究分析了SILVER-seq检测的exRNA浓度、片段长度和组织来源等信息，并在癌症患者和健康人群中进行了exRNA检测。

首先，研究人员检测了10份人体血清样本中的exRNA浓度和片段长度范围，并使用了四种RNA纯化试剂盒进行exRNA纯化，包括exoRNeasy、TRIzol LS、NORGEN和QIAzol，然后用生物分析仪进行定量。研究结果显示，这些血清样本中的exRNA浓度范围为0.3~4.2ng/mL，大多数exRNA长度在20~200个核苷酸（nt），表明SILVER-seq检测到的是人体血清中的小RNA或片段化的长RNA。

图3. 来自脑、外周神经系统和骨髓特定基因的exRNA数量和表达水平。图片来源：PNAS文章。

分析发现，SILVER-seq可检测到来自1/4以上人类基因的exRNA，包括小RNA、mRNA片段和长链非编码RNA（lncRNAs），其中部分exRNA来自具有组织特异性表达的基因，例如大脑、外周神经系统和脊髓组织中的基因。此外，研究发现，根据exRNA表达可完全分离男性和女性样本，并且exRNA表达与实际年龄相关（图3）。

图4. exRNA表达可区分癌症和非癌症样本。图片来源：PNAS文章。

值得注意的是，乳腺癌患者和健康人血清中的exRNA表达水平表现出显著差异。即使不使用差异表达的exRNA作为指标，几乎所有乳腺癌和健康对照样本以及大部分复发和非复发乳腺癌样本都可以通过exRNA表达进行正确分类（图4）。 这表明了在单滴血清液滴中使用exRNA进行液体活检诊断的临床应用潜力。

文章共同通讯作者、加州大学H. Irene Su教授表示：“这种新型SILVER-seq技术可对来自微量人血清的exRNA进行测序。根据研究结果，SILVER-seq可以区分不同性别、年龄和乳腺癌状态的样本，有望用于人类疾病的微创筛查和监测。”

文章另一共同通讯作者、加州大学钱煦教授表示: “我们的微量体液测序技术（SILVER-seq）能够从微量血液中检测游离RNA，有极高的敏感性和可重复性。我们发现血液里的游离RNA可以确切反映个人的生理和病理状态。这些临床数据为用一滴血做体检和疾病筛查及监测提供了重要的基础。”

目前，已有多项研究结果显示，exRNA为临床疾病的治疗提供指导和帮助。钟声教授团队开发的SILVER-seq技术可利用微量血清中的exRNA诊断人类生理和疾病状态，更容易用于临床疾病的筛查和频繁监测。同时，SILVER-seq可以发现血清中大量的长RNA片段，其中，部分RNA来自组织特异性基因以及癌症相关基因。因此，在基于液体活检的体外诊断研究中，exRNA可作为生物标志物用于疾病检测和监测，甚至开发基于exRNA的治疗手段。相信，随着技术的完善，人们对exRNA的临床意义和用途将会有更深的了解，这也将为实现多种疾病的临床治疗提供更加精准的信息。

随着精准医学的发展， 液体活检是当代医学最活跃的领域之一，近年来各种新技术不断涌现。在最新一期的《美国科学院通讯》（PNAS）上，美国加州大学圣地亚哥分校的钟声教授的团队开发了一种基于一滴血清的细胞外RNA(extracelluar RNA) 检测技术。文章显示，这种技术可以检测上万基因的RNA表达，基于这些基因表达信息可有效地反映病人的年龄、性别等生理指标，并可进一步区分癌症和正常样本。此文所代表的重要临床意义在于两点：第一，因为所用血的量极少，对于疾病防治采样的频率可以大大增加而不会给检测对象带来太大的负担；更重要的是，因为只需要一滴血，人们将不再需要到医院等专门机构进行抽血，而是可能在家中和便利店等场所方便地进行。总之，这项激动人心的液体活检技术突破为各种疾病的预防、诊断、监控和指导用药的“常规化”和“大众化”带来了新的希望。

近日，UCSD的钟声教授团队在国际权威杂志PNAS上发表了一种新型的体液RNA（exRNA：Extracellular RNAs）的测序方法，SILVER-seq（Small Input Liquid Volume Extracellular RNA Sequencing），可以从一小滴血清中直接对极微量的exRNA进行建库测序。该方法克服了传统的测序方法中体液起始量高的问题，其创新之处在于结合了EdgeSeq等体液建库方法和TSO等高效建库方法两者的优点，做到了对血液量的体积要求比EdgeSeq（25ul血浆）更进一步降低（3～7ul血清），并能同时捕获到小RNA和多种长RNA的片段（如mRNA、lncRNA等）。基于该方法，该研究对来自于96例乳腺癌和32例正常人的血清样本进行SILVER-seq，检测到了癌症和组织特异性的exRNA，可以用来准确区分癌症患者和正常人。此外，该研究结果还进一步确认了部分exRNA的表达在性别、年龄等不同人群中存在着一定的固有差异，这些exRNA的表达水平可以很好的衡量和预测性别和年龄（年龄预测准确性高达0.954）。总之，SILVER-seq技术为exRNA在液体活检中的应用增添了又一个新的、高效的测序方法，其初步结果在更多样本上进行交叉和泛化能力的检测后，就可以在疾病早筛、病情监测和癌症诊断上有很多很好的应用。

H. Irene Su

H. Irene Su, Professor of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Science in the Division of Reproductive Endocrinology and Infertility at the University of California, San Diego. She is the the PI of the POISE (Predictors of Ovarian Insufficiency in Young Breast Cancer) Study, a prospective cohort study in young breast cancer patients examining pre-chemotherapy predictors of time to menopause, where more than 215 participants were recruited from three sites.

Shu Chien（钱煦）

Shu Chien, Professor of the University of California, San Diego，Director of Institute in Medicine at UC San Diego. His work on the fluid dynamics of blood flow has had a major impact on the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases such as atherosclerosis. Chien is currently President of the Biomedical Engineering Society and is one of only 11 scholars who are members of all three U.S. national institutes: the National Academy of Sciences, National Academy of Engineering, and the Institute of Medicine. He and professor Sheng Zhong jointly served as the director ofNIH Common Fund 4D Nucleome Organizational Hub.

钟声

钟声，加州大学圣地亚哥分校生物工程系教授，美国医学与生物工程院会士，Genemo 公司的共同创始人。他曾师从王永雄教研究生物信息学。他的实验室主要研究基因调控如何影响细胞行为。实验室通过开发新的生物技术来绘制分子网络，包括RNA-RNA 相互作用组，RNA-DNA相互作用组和蛋白质相互作用组, 进而开发基于核酸的体外检测方法和治疗技术。他和钱煦教授共同担任美国国立卫生研究院共同基金四维核体组织中心主任。Genemo公司提供基于SILVER-seq技术的液体活检服务 (https://genemo.com) 。

参考资料：

Extracellular RNA in a single droplet of human serum reflects physiologic and disease states.