近日，耶鲁大学的研究团队开发了一种新的癌症免疫疗法，可利用CRISPR技术激活多个癌症相关内源基因，帮助人体免疫系统识别、攻击并杀死癌细胞。初步研究结果表明，基于CRISPR激活（CRISPRa）平台的多重激活内源基因免疫疗法（MAEGI，Multiplex Activation of Endogenous Genes as Immunotherapy），可有效杀伤或消除小鼠体内多种类型的癌症。10月14日，相关研究结果发表在Nature Immunology期刊上，文章题为“Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPRa elicits potent antitumor immunity”。

近年来，通过人体自身免疫系统抵抗癌症的免疫疗法彻底改变了癌症治疗的发展。免疫疗法可以识别由于癌细胞突变基因表达产生的异常肽，并将细胞标记为“非自身”或“异物”，触发免疫攻击。目前，免疫疗法主要包括免疫检查点抑制、过继性细胞疗法、人重组细胞因子（非特异性免疫疗法）、溶瘤病毒疗法和癌症疫苗。但以上这些治疗方法都面临着各种限制，并非万无一失，并且癌症细胞还可以逃脱免疫细胞的“检查”。

肿瘤相关抗原（TAA）是由癌症基因突变表达产生的，识别TAA是癌症免疫治疗的重要一步。其中的一个关键问题是：癌症基因突变的表达水平可能不足以引发有效的免疫反应，并且癌细胞常常下调抗原的表达和呈递，以逃避免疫识别。

为了解决癌症的免疫逃避难题，耶鲁大学Sidi Chen领导的研究团队开发了一种结合腺相关病毒（AAV）基因治疗和CRISPR 基因编辑的技术——MAEGI。与以往的免疫疗法不同，MAEGI方法不是寻找、编辑目标DNA位点并插入新基因，而是靶向特定癌细胞类型的癌症相关基因，通过精确定位、标记并放大信号，使免疫系统攻击标记的癌细胞。

图：结合AAV的CRISPRa增强了靶向抗原的表达和呈递。

首先，研究团队利用CRISPR激活技术，将催化灭活的Cas9（dCas9）与单向导RNA（sgRNA）组合，可靶向激活多个基因，调节数千个癌症特异性基因表达和抗原呈递，增强免疫系统的识别和杀伤力。同时，研究人员对MAEGI系统进行了多次升级，例如全基因组AAV-g-MAEGI。动物试验结果显示，全基因组激活处理的肿瘤在80%以上的小鼠体内被完全清除，并且这种肿瘤清除是由获得性免疫介导的。因此，AAV-g-MAEGI可以诱导宿主的获得性免疫反应，对抗多种侵袭性癌症类型。

图：AAV-p-MAEGI用于E0771小鼠治疗

随后，研究团队开发了AAV-g-MAEGI系统的升级版本，即AAV-p-MAEGI。通过全外显子测序，研究人员找出了E0771三阴性乳腺癌细胞系的所有突变基因，设计了靶向该肿瘤而不是正常乳腺组织的p-MAEGI CRISPRa精准激活库。因此，AAV-p-MAEGI系统可针对E0771乳腺癌细胞（三阴性乳腺癌）中的一千多个基因突变。结果显示，进行AAV-p-MAEGI治疗后，44%的患三阴性乳腺癌的动物表现出接近完全反应（NCR）或完全反应（CR）。令人兴奋的是，在肿瘤移植后的前三个月，所有表现出CR的9只动物仍可以完全清除同种肿瘤的攻击，并且这些动物都可以实现180天以上的长期完全缓解，表明AAV-p-MAEGI可以诱导有效、持久的抗癌反应。

同时，研究团队还在携带“局部”和“远距离”肿瘤的小鼠中检测了AAV-p-MAEGI。仅在局部肿瘤给予AAV-p-MAEGI治疗后，可同时观察到局部肿瘤和远距离肿瘤（未进行AAV-p-MAEGI治疗）的抗癌反应。经AAV-p-MAEGI治疗后，远距离肿瘤的CR率为67％。通过对肿瘤微环境中的免疫细胞群进行单细胞测序分析，结果表明，MAEGI可有效地增加靶基因的表达和抗原呈递，增强T细胞的效应功能，可将CD4+和CD8+T细胞募集到肿瘤微环境，促进局部和全身性抗肿瘤T细胞反应，包括三阴性乳腺癌、黑色素瘤和胰腺癌。

文章通讯作者、耶鲁大学医学院遗传学系Sidi Chen博士表示：“增强癌症组织中内源性基因的表达，可以放大癌细胞的“非自身”特性，进而标记为免疫攻击目标。MAEGI是一种全新的免疫疗法，可有效地将冷肿瘤转变为热肿瘤，有助于将效应T细胞募集到肿瘤并重塑肿瘤微环境，增强T细胞浸润和抗肿瘤免疫力。” 这种治疗策略就像为癌细胞打上了非常显眼的标记，免疫系统可迅速发现它们，并发动攻击。

这项发表在Nature Immunology的最新研究证明，通过CRISPR激活技术直接激活内源突变基因，可以放大癌细胞的特异信号，进而诱导有效的适应性抗肿瘤免疫力。多重内源基因激活方法可精准靶向多个基因甚至整个癌症基因组，且不伤害基因组，是一种通用且高度可扩展的策略，或对多种癌症类型有效，包括目前对免疫疗法有抵抗力的癌症。

作为一种潜在的肿瘤病毒基因疗法，AAV-p-MAEGI可用于原发肿瘤、转移灶或残留病灶的手术辅助治疗。更重要的是，当AAV-p-MAEGI激活内源基因时，肿瘤会获得额外的突变，这些突变仍然是MAEGI的目标。接下来，研究团队将继续优化该方法，为制造生产和癌症临床试验做准备。