昨日，由测序中国发布的“《Nature Medicine》连发两篇重磅研究，肿瘤液体活检版图或将面临重构！”的文章一度引发业内的广泛热议，令小编万万没有想到的是，该文章在不经意间给cfDNA肿瘤液体活检领域竟泼了一瓢“冷水”。
然而，事实并非如此！
该部分内容的初衷是针对cfDNA中所存在的大量克隆造血突变，希望能引起业内更广泛的关注。目前，除了少数专业机构，大多数临床cfDNA检测在采用肿瘤相关panel进行检测的同时，并不关注由WBC（白细胞）所产生的突变，这将导致大量的假阳性存在，例如由克隆造血产生的TP53或KRAS突变等，进而有可能对肿瘤患者的临床治疗决策产生误判。
图片来源：Nature Medicine
正如同期在《Nature Medicine》发表的社评中所描述：由于cfDNA液体活检方法的可及性高、侵入性低等因素，结合NGS技术的外周血浆样本分析正逐步纳入到临床检测中。但是，由于液体活检存在的局限性，因此我们必须慎重解决这些问题，以确保对肿瘤进行准确的分析，进而为肿瘤患者提供正确的治疗决策。具有高灵敏度的cfDNA突变检测技术有助于靶向疗法的准确应用。其中，更重要的是确保突变检测技术具有足够的能力来区分这些突变是来自于肿瘤，而不是其他组织。
事实上，由纪念斯隆·凯特琳癌症中心（MSKCC）和GRAIL公司联合研究团队在2019年11月25日《Nature Medicine》发表的这篇题为《High-intensitysequencing reveals the sources of plasma circulating cell-free DNA variants》的研究论文主要是介绍其所开发的一种超深度cfDNA-血白细胞匹配测序技术及其相关算法在肿瘤液体活检所展现的优势，共包含三大主要结论，分别对cfDNA检测的技术优势性、在TMB检测中的优势性以及cfDNA变异的来源做了系统的分析，此外，在研究的最后对cfDNA检测拷贝数变异（CNV）的可行性进行了评估。因此，该研究充分展示了cfDNA在肿瘤液体活检领域的优势性。
图片来源：Nature Medicine
该研究通过超高深度的靶向捕获方法（> 60000x）和基于贝叶斯模型的生物信息学方法有效区分了肿瘤来源的cfDNA变异与WBC来源的变异。一共针对124例转移性癌症患者，包括乳腺癌、非小细胞肺癌和前列腺癌。并对匹配的肿瘤组织、cfDNA 和白细胞（WBC）进行测序分析。另外，对来自47名未患癌症的对照个体的cfDNA 和WBC样本也进行了测序。针对肿瘤患者的肿瘤组织以及WBC，还采用了被FDA所批准的MSK-IMPACT肿瘤panel测序。
接下来，小编系统总结了该研究结果的三大主要结论，以纠正对此前报道所产生的误解：
cfDNA测序能够高敏感度的检测出肿瘤组织中的突变，甚至是肿瘤亚克隆中的突变；同时，还能够检测出大量未知突变，这些突变可能是由于肿瘤自身的进化以及高度的异质性所产生，并且是用肿瘤panel测序以及WBC高深度测序所检测不到的。
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主要结果如下：
图片来源：Nature Medicine
基于肿瘤组织的MSK-IMPACT检测出6例高分值TMB患者（检测阈值设定为：>13.8 mutations/Mb），cfDNA测序能检测到其中的4例（为了避免假阳性，基于cfDNA的检测阈值设定为：>22.7 mutations/MB）；另外2例为何没有检测出？一方面是由于这2例样本cfDNA含量过低，此外，由于cfDNA阈值设置过高而被遗漏。
值得注意的是，采用cfDNA测序的方法，还能够检测出其他6例高TMB患者，然而这些患者并没有被MSK-IMPACT组织测序方法所检测到；这是为何？原因可能如上所述，即cfDNA能够检测到肿瘤亚克隆的变异，因此仅在亚克隆中呈高TMB的患者往往会被组织检测所遗漏。
因此，基于cfDNA测序的方法共检测出了10例高TMB患者，而组织测序方法仅检测出6例！而这10例高TMB患者却携带了75%的cfDNA新突变。
对于MSI检测来说，cfDNA测序与组织测序均检测出1例MSI-H患者，且该患者表现出了对于免疫治疗的有效反应性。
图片来源：Nature Medicine
这部分的研究结果恰恰就是让人“惊掉下巴”的来源；的确，在114例低TMB的肿瘤患者中，cfDNA所检测的突变中，有一半以上（53.2%）是来自WBC，并且这些突变与肿瘤来源的突变没有相关性，而与年龄呈现正相关，说明这部分突变是来自克隆造血；结果同时表明，在89.5%的癌症患者中，cfDNA突变均存在克隆造血变异。为何这项研究检测出了如此之高的克隆造血变异？原因是由于此前的大多研究对WBC采用的是低深度测序，所检测出的克隆造血数目有限。
此外，cfDNA所检测的突变中，仅有24.4%是与肿瘤组织所检测的突变吻合；但不要忘了前面所说，cfDNA测序其实检测出了72%的肿瘤组织突变。为何会导致如此高的不一致性？这恰恰反映了cfDNA所检测到的大量组织测序无法检测到的突变信息，包括克隆造血变异以及存在于肿瘤亚克隆中的突变信息，后者或将产生更高的临床价值，具体如下所述。
在10例高TMB的患者中，肿瘤来源的突变数目显著低于低TMB的患者。这是为何？主要原因是由于高TMB患者肿瘤异质性往往更强，而针对肿瘤组织的测序由于取样部位的限制，无法检测到很多亚克隆的突变，因此，cfDNA测序所检测出的大量新突变（VUSOs）更显其价值；此外，在高TMB的10位患者中，携带有82.1%的VUSOs，而这一数值在低TMB患者中仅为35.4%。这也反映出，这些大量的VUSOs其实是来自于肿瘤的亚克隆，而组织测序无法检测到。那么，这些cfDNA测序所鉴定的大量新突变可靠吗？通过ddPCR的验证，结果完全一致！然而，不可忽略的是，在这些VUSOs中，也有部分是来自克隆造血。
作为该研究论文合作者之一的GRAIL公司，无疑是肿瘤cfDNA的热衷者。GRAIL公司成立之初所涵盖的三大原型检测方法就包括对cfDNA和白血细胞进行靶向配对测序以检测体细胞突变，如单核苷酸变体、小片段插入和缺失。其作为肿瘤早期液体活检领域的明星公司，长期以来均围绕cfDNA开展各类前瞻性研究。
此外，作为首个癌症NGS体外诊断产品获得FDA突破性认定的Foundation Medicine公司，其与Natera公司前不久刚刚达成战略合作，将共同开发基于cfDNA的个体化肿瘤液体活检监测方法。而Natera公司的Signatera产品在今年5月也已获得FDA突破性设备认定，用于癌症患者术后ctDNA的检测和定量。
今年，在全球范围内，多家从事cfDNA肿瘤液体活检公司加快了商业进程，例如，AdaptiveBiotechnologies公司在今年7月完成了高达3.45亿美元的首次公开募股（IPO）；同月，Freenome筹集了1.6亿美元的B轮资金；此外，成立不久并基于CancerSEEK的液体活检平台的Thrive Earlier Detection公司也完成1.1亿美元A轮融资。
基于肿瘤cfDNA开展液体活检的前提是寻找到有“意义”的微量ctDNA，其在癌症诊断方面的有效性已被大量研究所证明。尽管ctDNA仅占血液cfDNA总量的一小部分，但其在癌症基因检测中的应用前景却十分诱人。因为更早接受癌症诊断的患者与较晚接受诊断的患者在治疗结果上一直存在很大差距。目前，拥有商业化产品的液体活检公司，以及众多学术研究人员，纷纷投身于此，试图通过简单的血液检测以用来评估肿瘤大小、用药指导、监测治疗耐药性，监测疾病复发和预后。然而，不可否认的是截止到目前，液体活检在临床实践中的应用程度仍然很低。也正因如此，使得肿瘤液体活检领域充满了无限的色彩和对未来的憧憬。未来，在更多资源与资本的助力下，以及大批科学家、创业者、临床工作者参与下，基于液体活检的肿瘤基因检测领域必将推动精准医学迈向一个新时代。
参考资料：
1. High-accuracy liquid biopsies，https://www.nature.com/articles/s41591-019-0690-1
2. Razavi, P., Li, B.T., Brown, D.N, et al. High-intensity sequencing reveals the sources of plasma circulating cell-free DNA variants[J]. Nature medicine, 2019. doi:10.1038/s41591-019-0652-7
本文由 SEQ.CN 作者：陈初夏 发表，转载请注明来源！
