在本周召开的美国血液学学会年会（ASH）上，来自俄亥俄州立大学的研究人员报告了一种基于纳米孔测序的急性髓细胞性白血病（AML）快速检测方法，可在几个小时内检测分析AML患者血液样本中可用于临床和可预测的生物标志物。同时，研究团队还介绍了相关的验证研究结果，比较了该方法与短读长测序在检测AML相关变异方面的能力。

据悉，该检测方法由俄亥俄州立大学的Esko Kautto和James Blachly领导的研究团队开发，是基于Oxford Nanopore Technologies公司的MinIon测序仪进行设计，旨在对AML患者的血液DNA进行快速分析，使检测到的基因组变异可用于指导治疗或告知预后。研究人员认为，虽然该检测方法仍需在更大的队列中进行进一步的验证和评估，然后才能在临床中使用，但在不久的将来，该检测仍可能成为当前金标准方法的一种更快、更具成本效益的替代方法。

图：MinIon测序仪，来源：Oxford Nanopore Technologies官网

AML快速纳米孔测序检测方法的开发

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。AML占急性白血病的60%以上，多数病例病情急重、预后凶险，5年生存率仅为24％。AML通常具有侵袭性，因此患者在确诊的后必须迅速接受治疗。随着二代测序技术（NGS）的推广，新型靶向药物在AML治疗中不断涌现，部分药物已被批准用于携带某些基因突变的患者。

靶向治疗需要靶向诊断。目前，基于NGS的检测方法耗时较长。主要学术癌症中心的NGS方法可能需要一周以上的时间，而且无法进行检测的肿瘤科可能需要转诊患者。延误治疗或不恰当的治疗都可能对AML等侵袭性疾病患者造成严重影响。如果能成功开发出一种适用于临床的快速检测方法，将对AML的分子诊断起到重要作用。同时，该方法还可用于AML临床试验筛选，作为伴随诊断指导特定药物的治疗，也可用于监测微小残留病灶，以评估AML患者是否可以停用某种药物或进行其它治疗。

为达到这一目的，Kautto研究团队决定基于纳米孔测序开发一种快速检测方法。该方法依赖于扩增子文库和一个计算框架，可在测序仪产生数据后立即开始分析。在几个小时内，研究人员就可以得到大量测序数据的分析结果，以及在患者样本中检测到的任何突变的分析报告。

纳米孔测序比传统NGS更快，并且在仪器成本方面更便宜，但纳米孔测序具有更高的原始read错误率。据Kautto估计，纳米孔测序的原始错误率约为10%，对于低频突变检测来说，这一错误率就比较高了。“我们花了大量时间分析错误，并优化策略以减少错误的出现，我们认为这是该研究中最大的挑战之一。”

为解决这一难题，研究团队建立了质量分数的临界值，以过滤掉质量较低的测序数据，从而降低错误率。Kautto 表示：“这确实是可行的，因为将来自仪器的原始信号转换为核苷酸序列的算法可衡量其检出碱基的可信度。我们可以发现质量较低的reads，并将其排除在分析之外。”

新检测方法的性能验证

为验证新检测方法的性能，研究团队在72个野生型和突变样本中比较了纳米孔测序方法和短读长测序（Illumina的MiSeq测序仪）、毛细管电泳检测AML相关基因突变的能力，涉及8个基因：DNMT3A、FLT3、IDH1、DH2、JAK2、NPM1、NRAS、KRAS，并讨论分析了不同方法在三种类型变异中的检测性能，包括JAK2热点突变、NPM1移码插入和FLT3内部串联重复。

结果显示，在检测JAK2热点突变方面，纳米孔测序和MiSeq在8个突变体样本中表现出较高的相关性，等位基因分数的范围很广，在4%~94%之间。同时，研究人员还评估了纳米孔测序检测NPM1移码插入的能力。这种移码插入在30％的患者中发生突变，并且与AML复发风险增加有关。Kautto认为：“尽管纳米孔测序在indels缺失检测中有很高的错误率，但NPM1移码插入是序列末端独特核苷酸插入，突变特征非常明显。我们可以在背景噪声中将其识别出来，并且它实际上不会随机出现在我们的数据中。虽然在这种情况下检测到的等位基因变异比例低于预期，但这可以通过线性模型进行捕捉调整。”

FLT3内串联重复突变可导致AML患者的预后较差，目前已有多种靶向药物靶向这类突变。该突变可导致外显子13到15的多个部分重复，是一种很长的插入突变，很难用传统的NGS来检测。因此，FLT3内串联重复突变检测的金标准是毛细管电泳法。

研究团队利用48份样本比较了不同方法的检测性能，其中24份为毛细管电泳检测阳性。结果显示，纳米孔测序检测到所有24例阳性样本，传统NGS只检测到其中的6例阳性样本。研究人员认为，纳米孔测序检测到的等位基因比率与毛细管电泳相似，两者都确定了几乎相同长度的内部串联重复突变。更重要的是，纳米孔测序可在4~6小时内获得检测结果，传统NGS检测可能需要几天时间。

此外，这种基于纳米孔测序的检测方法也具有成本优势。在这项研究中，Kautto的研究团队使用MinIon flow cells，为样本添加条形码，可以一次收集和分析多个样本。据研究人员估计，利用FLongle flow cells进行分析，每个样本的成本将低于250美元。Kautto表示：“最理想的情况是使用一些较小的芯片以降低成本，还可以为患者样本进行单独检测。在临床检测环境中使用小型芯片将更安全，可避免样本污染。”

未来，该研究团队计划与其他大学合作，使用更多样本来验证这项检测方法。同时，他们还将改进计算步骤和文库制备，优化每个目标的覆盖率，完善其他基因分析，包括TP53等基因，并最终通过CLIA或CAP验证。