DNA甲基化是哺乳动物的关键表观遗传机制，其中5-甲基胞嘧啶（5mC）是最常见的DNA修饰之一。5mC对于哺乳动物的早期发育至关重要，在谱系特异性基因沉默、基因组印迹和抑制重复元件中起着核心作用。与之相反，在原核生物中5mC是罕见的，而N6-甲基腺嘌呤（6mdA）是其DNA甲基化的常见形式。

6mdA是细菌限制性修饰系统的基本组成部分，可使原核生物区分良性宿主DNA和潜在致病性非宿主DNA。目前在哺乳动物中缺乏已知的限制性修饰系统。近年来，Cell、Nature、Genome Res有多项研究报道，6mdA也存在于哺乳动物中，如小鼠胚胎干细胞、人类神经胶质瘤细胞。但仍有研究显示该结果存在不确定性。

近日，瑞典Linköping大学科学家发表的一项研究成果推翻了这一结论。该研究团队在Science Advances发表文章“No evidence for DNA N6-methyladenine in mammals”。结果显示，迄今为止发表的研究证据不足以证明在哺乳动物中存在6mdA这种细菌表观遗传修饰，此前哺乳动物细胞存在6mdA的研究很可能被污染。

来源：Science Advances

最初，为了进一步阐明6mdA在哺乳动物细胞谱系中的作用，瑞士研究团队在体外将人幼稚T辅助细胞（NTH）分化成T辅助细胞亚群（TH），利用已发表数据进行了全面生物信息学分析和新颖的实验。令人意外的是，他们发现TH细胞分化过程中6mdA的丰度并没有全局变化，并观察到6mdA在分化T细胞中的水平与非甲基化全基因组扩增DNA相同（图1A），表明在人T细胞中不存在可检测水平的6mdA。此外，研究人员在所有小鼠或人类组织中均未能检测到6mdA，这些样本均与缺少6mdA的全基因组扩增DNA对照中的信号相似（图1B）。这一发现与此前关于哺乳动物存在6mdA的结论相反，引起了研究团队的注意。

图1.免疫印迹显示在体外分化过程中人CD4+ T细胞（A）、人和小鼠原代DNA（B）中相对6mdA丰度。培养细胞系（上），全基因组扩增对照（中）和支原体污染（下）。来源：Science Advances

随后，研究团队分析了从六个人类细胞系中分离出的DNA中的6mdA，并鉴定出两个具有高于背景噪声水平的6mdA水平的细胞系。出乎意料的是，两种单独的T细胞系培养物具有不同的6mdA水平，表明此前研究观察到的6mdA信号并非细胞类型本身所固有的。经过进一步分析，研究团队证实两个6mdA水平升高的细胞系已被支原体属污染。（图2）支原体属一种常见的富含6mdA的细菌细胞培养物。当研究人员用支原体特异性抗生素处理细胞系时，发现6mdA信号降低为全基因组扩增阴性对照水平，证实6mdA阳性信号来源于支原体属污染。

图2.使用抗体试剂盒验证支原体阳性，虚线为支原体阳性阈值。来源：Science Advances

由于未能在任何未污染的哺乳动物DNA中检测到6mdA，研究团队试图验证已有方法的敏感性。因此，研究团队分析了此前在哺乳动物细胞中通过DNA免疫沉淀测序、质谱和单分子实时测序定位或检测6mdA的研究，并发现每种方法都有局限性或缺陷。他们意识到，通过这些技术检测到的6mdA'信号'只是噪声。但由于一些复杂的技术问题，几种方法中的背景噪声不是随机的，而是呈现出“真实”的信号。这使得表观遗传标记的假阳性发现率很高，也暗示着哺乳动物细胞中可能并不存在6mdA这种修饰现象。例如，对已发表MS数据的分析显示，即使在相同物种和细胞类型中，检测到的哺乳动物6mdA丰度也存在巨大差异（10到1000倍）。（图3）

图3.对已发表九项独立质谱研究中人类、小鼠、猪和大鼠DNA中6mdA丰度数据的分析，来源：Science Advances

该研究表明，RNA和细菌污染、抗体交叉反应性和其他技术限制已导致人们在哺乳动物DNA中错误地识别6mdA。随着DNA和RNA修饰家族的不断壮大，未知表观遗传修饰的丰度越来越低，即使使用多种互补方法，也存在错误发现的可能。因此，研究团队建议在未来的罕见DNA修饰研究中，使用修饰和未修饰的基因组DNA标准品作为最低标准要求，并在使用前进行更全面地抗体特异性验证。

文章通讯作者Colm Nestor表示：“在研究罕见的DNA现象时，必须非常小心地选择使用哪种方法，并考虑是否真正在衡量存在的事物。我们认为，迄今为止发布的研究证据不足以支持哺乳动物细胞中存在6mdA表观遗传修饰。”

参考资料：

1.No evidence for DNA N6-methyladenine in mammals, 18 Mar 2020. Science Advances

https://advances.sciencemag.org/content/6/12/eaay3335

2.Researchers Find No Evidence to Support Presence of Bacterial Epigenetic Mark in Mammals

https://www.genomeweb.com/genetic-research/researchers-find-no-evidence-support-presence-bacterial-epigenetic-mark-mammals#.XndxnDMpj2c