希望组与天津生物芯片两家公司强强联手，结合各自多年在动植物基因组组装方面的实战经验、整合双方优势资源，联合首推Nanopore Ultra-long Reads+PacBio HiFi Reads+Bionano+HiC的基因组近完成图解决方案，突破现有基因组技术指标，为客户提供更有效、更完整、更准确的基因组图谱，为后续基因组进化、基因组结构变异、基因功能研究等更深入的研究奠定基础。

现有常用策略组装的动植物基因组通常都是不完整的，最主要的原因是基因组中重复序列太长（尤其是着丝粒和端粒区域），而测序Reads太短难以跨越重复区域。三代测序相比二代测序在读长方面有了极大的提升，但是仍有较多长重复区域的组装错误[1]。Nanopore Ultra-long Reads是现有技术中解决这一问题的最佳方法之一，Ultra-long Reads N50可达100Kb以上能够有效跨越基因组中上百Kb的大片段重复，甚至着丝粒区域[1,2,3]。

图1 单项目Ultra-long Reads产量及N50分布

据悉，希望组是目前国内少数能稳定产出高质量Nanopore Ultra-long Reads的服务商之一（图1），基于Ultra-long Reads的动植物基因组组装经验丰富。例如，某基因组大小约10G的单子叶植物，采用Ultra-long Reads组装contig N50达93Mb(表1)。Nanopore Ultra-long Reads组装，透视基因组复杂区域，为基因组近完成图打下坚实的基础。 

表1 某单子叶植物基因组Ultra-long Reads组装结果

Nanopore Ultra-long Reads解决了基因组复杂区域的组装问题，但只有近完成图的底子，其单碱基准确度仍略显不足。目前主流的解决方法是利用二代测序数据进行Polish，但是二代测序在基因组高GC区域有偏好性，产生的短读长不能均匀覆盖基因组，Polish后的基因组仍有许多单碱基错误和小InDels[1]。在实际项目经验中，研究人员发现采用PacBio HiFi Reads对基因组Polish效果更好。

PacBio 升级至Sequel II后HiFi Reads单碱基准确性有了极大提升，并且HiFi Reads测序过程没有GC偏好性，覆盖基因组更加均匀，避免了短读长的多位点比对错误，Polish后的基因组准确度更高。

天津生物芯片自2013年开展PacBio测序至今，数年来一直深耕PacBio样品处理、文库构建、上机测序及数据组装技术，目前Sequel II 平台采用最新的2.0试剂，HiFi模式 Total Bases超过了400Gb，CCS Bases 达到了30Gb以上。PacBio HiFi Reads不仅能够De novo组装，还能够解决高杂合度基因组Phasing问题，以及实现高质量基因组的Polish。同时，高通量的测序数据产出，能够有效降低测序成本，节省纠错时间，缩短组装周期，成为获得动植物近完成图基因组不可或缺的重要手段。

表2  测序及组装结果统计（某高杂合木本植物基因组）

工欲善其事，必先利其器。不同物种的基因组组成各有特点，基因组近完成图组装过程也会遇到各种问题，如果没有强大的组装软件，Ultra-long Reads与HiFi Reads仅仅是一堆数据。NextDenovo是希望组自主研发的三代测序数据高效纠错、组装软件，解决了现有三代测序数据组装工具资源占用大、运行时间长、组装质量不稳定的瓶颈。NextDenovo已经实现了单Contig组装一条染色体的突破，组装的水稻93-11（Oryza sativa L. 2n=24）基因组仅包含18条 Contigs，至少有一半的单条染色体由单个Contig装出（图2）。NextPolish[4]是希望组开发的解决Nanopore测序数据组装基因组准确度的工具包，运行性能优于现有主流三代基因组Polish工具。希望组自主组装算法可以针对不同物种的基因组特点进行优化，是实现基因组近完成图的核心工具。

图2 利用NextDenovo组装水稻93-11染色体树状图

Bionano 光学图谱技术是基于DNA中一些可识别的限制性酶切位点在DNA上的物理位置而构建的图谱。该技术无片段化操作，无PCR过程，反映DNA最真实的信息，改善了基因组结构的可视化，以最连续、最精确的组装获得染色体臂和完整的染色体图谱。在Ultra-long Reads组装+HiFi Reads Polish的基础上，利用Bionano数据矫正和验证基因组序列组装的的准确性和完整性，从而使组装质量更上一层楼（表3）。

表3 希望组Bionano辅助组装案例

没有达到染色体水平，怎敢称为基因组近完成图？Hi-C技术是是基因组近完成图最后的点睛之笔。Hi-C染色质构象捕获根据染色质片段间的交互强度随距离衰减的规律，利用高通量测序技术，获得整个染色质三维空间互作关系[5]，将scaffolds基因组序列进行染色体群组的划分、排序、定向，对组装准确性进行再次校正，将组装提升到染色体水平。

参考文献：

[1] Lang D, Zhang S, et al.Comparison of the two up-to-date sequencing technologies for genome assembly: HiFi Reads of Pacbio Sequel II system and ultralong reads of Oxford Nanopore,bioRxiv 2020.02.13.948489; doi: https://doi.org/10.1101/2020.02.13.948489.

[2] Miga K H, Koren S, Rhie A, et al. Telomere-to-telomere assembly of a complete human X chromosome[J]. BioRxiv, 2019: 735928.

[3] Jain M , Koren S , Miga K H , et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads[J]. Nature Biotechnology, 2018.

[4] Hu, J., Fan, J., Sun, Z. & Liu, S. NextPolish: a fast and efficient genome polishing tool for long-read assembly. Bioinformatics btz891 (2019) doi:10.1093/bioinformatics/btz891.

[5] Burton, J., Adey, A., Patwardhan, R. et al. Chromosome-scale scaffolding of de novo genome assemblies based on chromatin interactions. Nat Biotechnol 31, 1119–1125 (2013). https://doi.org/10.1038/nbt.2727