肿瘤细胞通过表型上的变异来躲避免疫系统的识别和杀伤，而这些变异不仅能加速肿瘤细胞的扩散，还会使其对免疫疗法产生耐受。过去对免疫治疗后的癌症患者基因的研究局限于寻找高频基因变异。近期使用CRISPR-Cas9系统进行功能筛选给研究免疫逃逸的机制带来了希望，但是肿瘤细胞中基因如何通过改变表型来进行免疫逃逸还缺乏系统性的研究。

近日，来自加拿大多伦多大学的Jason Moffat团队在《自然》（Nature）杂志发表了题为“Functional genomic landscape of cancer-intrinsic evasion of killing by T cells”的论文（Lawson et al., 2020）。他们通过在小鼠肿瘤细胞系中进行CRISPR筛选，成功鉴定出了182个介导免疫逃逸的基因，称作“核心癌症固有免疫逃逸基因”（Core Cancer Intrinsic Immune Evasion Genes），并发现了多个与免疫逃逸相关的通路，其中调控干扰素信号（IFNγ）通路的基因在介导免疫逃逸的过程中发挥关键作用，自噬通路相关的基因可以对IFNγ和TNF产生的细胞毒性产生抗性。另外研究者还发现了自噬相关的基因可以与NF-κβ通路的基因发生复杂的交互作用，从而控制肿瘤细胞的免疫逃逸。这项研究不仅系统鉴定了肿瘤细胞参与免疫逃逸的相关基因，同时也揭示了基因间的相互作用对免疫逃逸的影响。

首先，研究团队通过CRISPR-Cas9技术在6个小鼠癌症细胞系中构建了能够敲除19,069个蛋白编码基因的导向RNA（gRNA）文库（图1），初步筛选出了182个对细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）杀伤作用有抵抗性或敏感性的“核心癌症固有免疫逃逸基因”。与癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas）数据中T细胞抗肿瘤应答相关基因集对比分析后发现，这些核心免疫逃逸基因与干扰素γ应答（IFNγ response）、白细胞占比（Leukocyte fraction）、先天性抗PD1耐药性（Innate anti-PD-1 resistance）之间存在相关性。

图1. 本研究使用的小鼠细胞系和CRISPR筛选的研究方案

调控IFNγ信号通路的基因在182个核心免疫逃逸基因中排名靠前，因此团队在添加了IFNγ的小鼠肾癌（Renca）细胞中使用CRISPR进一步筛选出癌症细胞中对IFNγ处理产生应答的基因，结果显示敏感基因中自噬相关的基因和Fitm2基因排名靠前（图2）。Fitm2与小鼠脂肪组织的储存至关重要（Miranda et al., 2014），但其与IFNγ通路的关系仍然未知。研究者接着构建了Fitm2敲除的Renca细胞系，并使用IFNγ或CTL筛选，发现了与Fitm2有正向或负向交互作用的基因。意外的是，自噬基因的敲除对Fitm2介导的IFNγ敏化作用有抑制（图3），这说明基因间的交互对细胞的免疫逃逸具有重要影响，先敲除Fitm2，再敲除自噬基因，反而会使癌症细胞对IFNγ产生抗性。

图2. 在添加了干扰素的Renca细胞中使用CRISPR进行全基因组筛选后的基因NormZ分数排名。其中黄色为抗性基因，蓝色为敏感基因

图3. 选择敲除Fitm2和自噬基因后经过IFNγ和CTL筛选得到的不同结果

当在只添加IFNγ的情况下，敲除自噬基因会抑制Fitm2对癌症细胞的敏化作用；而添加激活的CTL则不会（图3），这说明CTL产生的其它细胞因子会对敲除自噬基因后的癌症细胞产生作用。由于核心免疫逃逸基因在TNF与NF-κβ通路中有强烈的富集，研究者推测自噬基因可能在调控TNF的抗性中发挥作用。通过CRISPR筛选经过TNF处理的Renca细胞证实了他们的猜想，在自噬基因和NF-κβ信号通路的基因敲除后，癌症细胞对TNF的反应变得敏感（图4）。

图4. 在添加了TNF的Renca细胞中使用CRISPR进行全基因组筛选后的基因NormZ分数排名。其中黄色为抗性基因，蓝色为敏感基因

为了进一步确定哪些基因决定了自噬基因介导的免疫逃逸，研究者在敲除自噬基因Atg12的Renca细胞系中使用TNF和CTL进行CRISPR筛选，结果显示Atg12与NF-κβ通路下游的基因发生负向交互作用，而与上游的基因通常发生正向交互作用。这说明自噬作用和NF-κβ通路的基因在共同调控免疫逃逸过程中存在复杂的交互关系。令人意外的是，发生双重自噬基因突变的癌症细胞对TNF和CTL产生了强烈的抗性，这个结果与单独敲除某个自噬基因后的癌症细胞反应正好相反（图5），这一发现意味着，当治疗某个自噬基因突变的患者时，采用靶向另一种不同自噬基因的疗法可能会适得其反，这对临床癌症治疗具有启发性的意义。

图5. 自噬基因家族间的交互作用在经过TNF或者CTL筛选后导致不同的结果

为了深入研究自噬基因在肿瘤微环境中发挥的功能，作者构建了能够敲除182个核心免疫逃逸基因的gRNA文库，并在免疫能力完整和缺失的小鼠体内分别进行CRISPR筛选（图6）。作者发现敲除某个自噬基因的癌症细胞在实验后期对具有免疫能力的小鼠敏感性增加，这一发现证实了自噬基因在肿瘤微环境中可以介导癌症的免疫逃逸（图7）。

图6. 在小鼠体内进行CRISPR筛选的设计方案

图7. 上图：BALB/c背景的小鼠与NCG背景的小鼠在实验前期和后期gRNA丰度相对于实验起始时刻改变的平均倍数的差异分布。下图：自噬基因的gRNA丰度改变的平均倍数的差异分布

综上所述，Jason Moffat团队的这一系列研究结果不仅在分子水平为我们揭开了助力癌症细胞躲避免疫系统追杀的神秘面纱，鉴定出了182个核心免疫逃逸基因和相关的信号通路，挖掘出自噬基因与免疫抗性间的关系，更是对肿瘤临床研究和免疫治疗有着突破性的指导意义。

参考资料：
1. Lawson, K.A., Sousa, C.M., Zhang, X., Kim, E., Akthar, R., Caumanns, J.J., Yao, Y., Mikolajewicz, N., Ross, C., Brown, K.R., et al. (2020). Functional genomic landscape of cancer-intrinsic evasion of killing by T cells. Nature 586, 120–126.
2. Miranda, D.A., Kim, J.-H., Nguyen, L.N., Cheng, W., Tan, B.C., Goh, V.J., Tan, J.S.Y., Yaligar, J., KN, B.P., Velan, S.S., et al. (2014). Fat Storage-inducing Transmembrane Protein 2 Is Required for Normal Fat Storage in Adipose Tissue. J. Biol. Chem. 289, 9560–9572.