目前，基于血液用于免疫治疗的生物标志物主要集中在细胞游离DNA（cfDNA）或循环肿瘤细胞。这些标志物可反映肿瘤的特性，但不能反映治疗过程中免疫系统的变化。为了改善对免疫检查点抑制剂（ICI）耐药性的预测和跟踪，同时获得肿瘤和免疫系统的转录组特征是至关重要的。科学家关注的另一种标志物——细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）是由包括肿瘤细胞和免疫细胞在内的多种细胞类型产生。

已有研究显示，在癌症中，肿瘤分泌的EV参与调节肿瘤微环境并引起抗肿瘤免疫反应，而血浆来源的EV转录物是抗肿瘤免疫活性的标志物。EV可由包括CD4+ /CD8+ T细胞、树突状细胞、调节性T细胞和巨噬细胞在内的多种免疫细胞分泌。在肿瘤发展过程中，血浆中总EVs和肿瘤特异性EVs均升高。

基于此，麻省理工学院（MIT）计算机科学与人工智能实验室、哈佛大学和麻省理工学院博德研究所的研究团队推断，血浆来源的EV既包括肿瘤来源的EV，也包括非肿瘤来源的EV，从而可重构肿瘤固有和非肿瘤信号。研究团队希望通过鉴定EV中的生物标志物，以实现对肿瘤和宿主免疫状态的无创监测，并预测ICI反应。

近日，该联合团队将最新研究成果发表在了Science advances期刊上。研究人员通过对来自接受ICI治疗转移性黑色素瘤患者的血浆EV和肿瘤进行转录组分析，发现血浆来源的EV和肿瘤转录组相关，并且EV可揭示ICI耐药性和黑色素瘤进展的驱动因素、差异表达基因/途径，并与ICI的临床治疗反应相关。因此，EV转录本或可预测或反映对ICI的耐药性。该文章题为“Plasma-derived extracellular vesicle analysis and deconvolution enable prediction and tracking of melanoma checkpoint blockade outcome”。

研究团队利用转录组微阵列芯片分析了50例转移性黑色素瘤患者接受ICI治疗前和治疗后外周血来源EV中的RNA，获得了evRNA-seq数据，其中33例患者有应答，17例患者无应答。其中一组患者治疗后，研究人员采集了15例血浆样本和26例肿瘤样本，并对四种黑素瘤细胞系和配对EV进行了分析。此外，研究团队通过一个包括30名患者（14名应答者和16名无应答者）的独立队列进行了结果验证。

值得关注的是，为了解释混合血浆来源的EV数据，该研究团队开发了一种新方法——贝叶斯反卷积（Bayesian deconvolution）计算模型，以区分肿瘤和非肿瘤来源的转录本。这是第一个能够识别EV组分的潜在来源并追溯有关起源组织的可检验假设模型。

结果显示，EV的基因表达情况和黑色素瘤细胞系相似。基因富集分析发现，EV富集了免疫相关信号，主要包括：中性粒细胞、NK细胞、CD4+/CD8+ T细胞激活，巨噬细胞/肥大细胞耗损等。表明EV富集了对于免疫人群对抗1型程序性细胞死亡（PD1）反应很重要的信号，或可预测黑色素瘤患者ICI治疗前和治疗期间的应答与耐药情况。

图1. 肿瘤与EV RNA的一致性。来源：Science advances

基因差异表达分析发现，在应答者和无应答者之间有258种通路存在差异，其中25种通路存在显著差异。其中，T细胞受体、CTLA4、TGF -b、SMAD2/3、Notch、肿瘤坏死因子受体、血管内皮生长因子受体通路涉及ICI抵抗和黑色素瘤进展。在治疗过程中，无应答者T细胞受体通路活性的降低和CD28通路发生共刺激。

同时，研究团队发现，共享的DEGs（差异表达基因）可反映丰富基因集，例如KLF10、TGF-b通路基因、WNT8B通路基因等。对比患者接受ICI治疗前后，Notch、TGF-β和MAPK相关信号转导（ERRB4）和角化通路基因会发生变化。DEG分析发现，免疫和肿瘤相关通路的基因表达变化均会引起ICI耐药，包括CD1A、MAP2K4、TRBV7-2、IGFL1、microRNAs（例如miR551A）等。经过多方DEGs验证，研究发现IGFL1、TFF2和MAP2K4基因在预测无进展生存期或总生存率方面显示出统计学意义。

图2. EV中IGFL1基因与无进展生存期和总生存率的关系。来源：Science advances

此外，该研究建立的贝叶斯反卷积计算模型可通过对照黑色素瘤相关的KEGG路径，准确区分肿瘤与非肿瘤来源的转录本。例如，该模型发现KLF10基因转录本来源于非肿瘤成分，提示ICI治疗后的差异变化可能与KLF10的TH1/TH17诱导极化功能有关，而不是肿瘤抑制作用。

图3. EV的反卷积和RNA-seq中驱动突变的分析。来源：Science advances

最后，该研究分析了evRNA-seq检测到的突变信息是否可以对ICI应答者和无应答者进行分层，并未患者匹配了肿瘤突变负荷（TMB）的数据。结果显示，应答者相对于无应答者的COSMIC体细胞突变率显著更高。高突变率的患者总体存活时间更长。无进展生存log秩检验不显著，提示evRNA-seq癌症驱动信息可能更有效地预测ICI治疗的长期疗效，而不是短期疗效。

图4. 在应答者和非应答者中比较COSMIC突变负荷。来源：Science advances

长久以来，因缺乏有效的生物标志物，诸如PD-1等免疫治疗在患者群体中的总有效率不高。该研究发现，EVs作为一种非侵入性生物标志物，或可用于同时检测ICI的肿瘤内在和免疫的分子变异，可作为潜在的ICI应答预测标志物用于患者分层，并监测免疫治疗的持久性和免疫激活。此外，研究团队表示，虽然来自evRNA-seq数据的突变信息的实用性不太可能会超过深度cfDNA或WES TMB数据，但相关突变信息已嵌入大量提供的转录组信息中，反映了动态肿瘤变化，并可以在ICI监视和响应预测中补充其他基于DNA的测序方法，例如ctDNA和EV DNA测序。