单细胞RNA-seq技术已经在绘制器官基因表达谱研究中发挥了关键作用，但目前很难系统地鉴定和定位单个器官中所有分子细胞的类型，并创建完整的分子细胞图谱。近期发表的研究成果中，多个细胞类型特异性标记分子被识别出来，为细胞类型的分子定义和功能研究提供了帮助。

近日，美国斯坦福大学研究团队利用单细胞RNA-seq分析创建了一个全面的成人肺分子细胞图谱。该研究共对人类肺部组织和循环血液中的约75,000个细胞进行了测序，并结合多方面的细胞注释方法，鉴定出肺部的58种细胞类型。该研究成果已发表在顶级期刊Nature上，文章题为“A molecular cell atlas of the human lung from single-cell RNA sequencing”。

研究团队获取了人肺部的正常组织，包括支气管（近端）、细支气管（中端）和肺泡（远端）区域以及外周血。样本处理成细胞悬液后，被分为上皮细胞（EPCAM+）、内皮细胞/免疫细胞（CD31+/CD45+）和基质细胞（EPCAM-、CD31-、CD45-）。该研究利用10x Chromium发现罕见细胞类型 ，再通过SmartSeq2获得更深入的转录信息。通过基于液滴和孔板的单细胞RNA测序（droplet- and plate-based single-cell RNA sequencing），研究团队对所有肺组织间室和循环血液中的约75,000个细胞进行了测序，结合多种细胞注释方法，最终绘制了一个全面的人肺分子细胞图谱。

该图谱揭示了人类肺部58个细胞群的基因表达谱和解剖位置，包括45种已知细胞类型中的41种和14种未知细胞类型。这58种分子类型细胞包括15种上皮细胞，9种内皮细胞，9种基质细胞和25种免疫细胞。

图1. 通过迭代聚类发现组织细胞的scRNA-seq谱。来源：Nature

该图谱定义了几乎所有典型肺细胞类型（91%）的全基因组表达谱，从最丰富的（毛细血管，约占肺细胞的23%）到极其罕见的（离子细胞，约占0.01%）。其中，1/4的细胞类型此前缺乏高质量的单细胞转录组。同时，研究团队通过对21种已分类的人类血细胞进行RNA测序，定义了循环免疫细胞的转录谱。在肺和血液单细胞RNA-seq分析中，使用了典型免疫标记和差异表达基因panel来分配25个免疫细胞簇。

图2. 人类肺免疫分子类型聚集与注释。来源：Nature

该分子图谱可鉴定肺细胞的生化功能和转录因子标记。分析发现，三组细胞簇（增殖基底细胞、增殖自然杀伤/T细胞、增殖巨噬细胞）的周期基因表达丰富，表明它们是最富增殖能力的肺细胞类型。研究发现了两簇肺泡2型（AT2）细胞，可以产生表面活性物质，防止肺泡塌陷。这些细胞混杂在肺泡上皮中。此外，研究团队在肺内皮腔内发现了意想不到的分子多样性，并鉴定了新基质类型。两个簇表达经典成纤维细胞标记物（BSG和COL1A2），其中一个簇定位于肺泡，另一个簇定位于血管外膜和邻近气道。

图3. AT2标记表达的点图(10x数据集)与smFISH和细胞定量评分。来源：Nature

利用该图谱，研究团队确定了受肺部疾病基因和呼吸道病毒直接影响的细胞类型，并分析了233个现存肺部疾病基因的表达数据，可以确定疾病的细胞起源。该数据可支持12种疾病27个基因的已知或疑似“罪魁祸首”细胞，并确定了15种疾病涉及21个基因的细胞类型，包括肺动脉高压的周细胞、房室发育不良的毛细血管和慢性阻塞性肺病（COPD）的AT2细胞。同时，该图谱还绘制了80个编码病毒受体基因的表达情况，其中包括呼吸道病毒的26个基因。

通过比较人类和小鼠的数据，该研究确定了17种在肺进化过程中获得或丢失的分子细胞类型，及表达谱发生重大变化的分子细胞类型，揭示了细胞类型和细胞类型特异性基因表达在器官进化过程中的广泛可塑性，包括细胞类型之间的表达转换。

图4. 肺细胞类型和表达模式的进化差异。来源：Nature

研究团队表示，这是一项艰巨的挑战，因为不同细胞类型具有不同的结构、位置和丰度，其变化范围超过5个数量级。该分子细胞图谱可为监测肺部所有细胞类型以及它们在发育、衰老、疾病和进化过程中如何变化提供最佳标记和基准，以及为研究肺细胞功能和相互作用提供了分子基础，将对肺相关生理学和医学研究产生广泛影响。