首先，单细胞转录组数据的Unique Molecular Identifier（UMI）的基因表达矩阵作为CopyKAT的输入，通过它们的基因组坐标对它们进行排序，并对基因的排列进行注释。之后，用Freeman-Tukey变换来稳定方差，然后采用多项式动态线性建模矫正单细胞UMI计数矩阵中的异常值。

下一步是建立一个高可信度的正常二倍体细胞子集，用来推测正常二倍体细胞的拷贝数基线值。为此，研究人员将所有单细胞集中到几个小的亚群分类中，并使用高斯混合模型估算每个分类的方差。通过严格的分类标准，具有最小估计方差的聚类被定义为“标准的二倍体细胞”。

为了检测染色体断点，他们整合泊松-伽玛模型和马尔可夫链蒙特卡罗迭代生成每个基因窗口的后验均值，然后应用Kolmogorov-Smirnov检验对均值无显著差异的相邻窗口进行合并，然后计算每个窗口的最终拷贝数值，以此作为跨越每个细胞中相邻染色体断点的所有基因的后验平均值。

然后对单细胞拷贝数数据进行分层聚类，以确定非整倍体肿瘤细胞和二倍体基质细胞之间的最大距离。最后，根据聚类信息识别克隆亚群，并计算代表亚克隆基因型的共表达谱，进一步分析其基因表达的差异。

研究结果表明，在220 kb的基因组分辨率下，CopyKAT的预测结果与标准参考DNA拷贝数信息具有很高的一致性（皮尔森相关系数为0.82）。inferCNV的预测结果也具有较高的一致性（皮尔森相关系数为0.79）。然而，inferCNV的主要局限性是不能检测染色体断点的具体坐标或拷贝数片段，而CopyKAT则可以实现这些。

接下来，通过在不同基因大小区间的相邻局部区域重复采样，他们进一步计算了从两种方法推断的拷贝数状态与参考DNA拷贝数信息的相对差距。分析结果表明与inferCNV相比，CopyKAT更接近参考DNA拷贝数状态（P < 0.001, t检验）。此外，数据还表明，在5 ~ 500个基因区间内，CopyKAT具有更稳定的表现。

图3. CopyKAT与inferCNV性能的比较（二），来源：Nature Biotechnology

结果表明，CopyKAT具有很好的区分能力，比如根据5例胰腺癌患者的9,717个单细胞转录组，CopyKAT成功地在所有个体中鉴定出非整倍体肿瘤细胞亚群。预测的肿瘤细胞具有全基因组拷贝数异常，包括频繁扩增的1q、3q、7p、8q、17、19和20以及缺失的3p、6和8p，这与之前的研究报道是一致的。同时，预测得到的非整倍体肿瘤细胞的UMAP投射与表现出高上皮基因得分的细胞亚群共定位，这也体现了这些细胞的肿瘤特性。

图4. CopyKAT可将人类肿瘤中癌细胞和正常细胞分类，来源：Nature Biotechnology

结果表明，CopyKAT能够区分出肿瘤细胞的亚克隆结构，比如克隆A的亚克隆扩增（4p, 7q, 9p13.2-q22.2和17q）；克隆B的亚克隆扩增（3p26.3-p25.1, 6q, 7p, 11q，Xp11.23和Xq）。

差异分析在两个亚克隆中共鉴定出329个差异表达基因，在亚克隆A中，包括雄激素反应和上皮-间质转化等特征显著富集；并且这两个预测出的非整倍体亚克隆在降维图上也对应不同的细胞亚群。因此，这些结果表明，CopyKAT可以从单细胞转录组数据中解析肿瘤的克隆拷贝数亚结构，并识别出亚克隆的差异。