5'- untranslation region （5'-UTR）位于编码序列上游的非编码基因区域内，在调控基因表达中起着关键作用。研究发现，5'-UTR的DNA序列中有许多顺式调节元件，可以与转录因子相互作用，调节信使RNA （mRNA）的丰度。此外，5'-UTR转录本由多种基于RNA的调控元件组成，这些元件可以改变mRNA翻译效率，部分元件还可以通过改变稳定性或降解影响mRNA转录水平。

5'-UTR突变在癌症和基因表达中具有十分重要的地位。近期的大型队列研究报道了多种癌症中反复发生的体细胞5'-UTR突变，这些突变或可能影响恶性肿瘤表型。但在转录和翻译水平上对癌症进展过程中5'-UTR突变的系统性功能研究还未见报道。目前，大规模并行报告基因分析（MPRAs）已被用于分析各种调控元件突变的功能性影响。但已有的高通量技术只能分析长度小于200bp的短基因组区域，对分析具有超长碱基数（大于3000bp）的5'-UTR巨大的限制。因此，迫切需要技术创新克服这些障碍，对功能性癌症相关的5'- UTR组进行分析。

近日，Fred Hutchinson肿瘤研究中心Andrew C. Hsieh研究团队开发了一种用于全长5'-UTR多重功能基因组学的高通量方法，并在Nature Communications上发表了题为“Multiplexed functional genomic analysis of 5’ untranslated region mutations across the spectrum of prostate cancer”的研究文章。为了量化人类前列腺癌中体细胞5'-UTR突变的影响，研究团队开发了一种称为PLUMAGE （Pooled full-length UTR multiple Assay on Gene Expression）的高通量多重功能基因组学方法。该方法通过将长、短读长测序技术相结合，克服了传统MPRAs对序列长度的限制。该研究精确量化了基于患者的体细胞突变对mRNA转录水平和翻译效率（TE）的影响，揭示5'-UTRs突变图谱可以协同基因表达的多种机制。该研究结果强调了非编码基因组在癌症发病机制中的分子意义，并揭示了此前未发现的致癌基因调控节点。此外，PLUMAGE方法为5'- UTR功能基因组学提供了技术平台，可应用于大多数基因驱动的疾病。

研究团队在五个前列腺癌患者队列中分析了所有体细胞5'-UTR单核苷酸突变，共获得326个5'-UTR突变。利用基于人体组织的转录组分析和核糖体分析技术，研究发现12%~40%的5'-UTR突变与转录水平的增加或减少有关，15%~38%的5'-UTR突变与mRNA翻译效率（TE）的改变显著相关，揭示了基因表达的多重调控。

研究团队在更大的前列腺癌患者队列中对全基因组5'-UTR突变的功能研究。常用的核糖体分析费力且通量低，难以在数百个患者样本上实施。此外，染色体改变将难以明确推断5'-UTR内单点突变的因果关系。为此，研究人员开发了PLUMAGE，用来评估基于前列腺癌患者体细胞5'-UTR突变对mRNA转录水平和翻译率的影响。结果显示，该方法可鉴定所有具有正确全长5'-UTR序列的质粒，并正确连接到其相应的独特条形码。功能验证也重复了之前的研究结果，表明PLUMAGE可用于全长5'-UTR和基于患者体细胞5'-UTR突变在mRNA转录和翻译中基因调控的大规模平行研究。

利用PLUMAGE，研究团队在1878个基因中鉴定了2200个体细胞5'-UTR单核苷酸变异。通过分析在患者中发现的反复突变5'-UTR 的基因组位置，38.7%的突变位点位于彼此50bp之内（图2）。使用HOMER数据库获取DNA结合元件和Hughes数据库获取人类RNA结合蛋白位点，研究人员确定了311个突变产生了新的DNA结合元件，478个突变影响RNA结合蛋白位点（图2）。总体而言，以上数据表明DNA和RNA顺式元件中存在5'-UTR突变，它们可能在功能上影响mRNA转录水平和mRNA翻译。

为全面分析 5'-UTR 突变的功能图谱，研究团队构建了第二个PLUMAGE文库。该文库由914个合成的全长5'-UTR序列组成，涵盖545个所有癌症相关体细胞5'-UTR突变，可对每个突变和未突变的5'-UTR进行深度分析。结果显示，190个（34.8%）5'-UTR突变具有功能性改变，显示出mRNA转录水平或翻译效率的显著变化（图3）。重要的是，这些功能性突变影响了癌症相关通路的基因，表明5'-UTR突变可以在转录或翻译水平上解除前列腺恶性肿瘤中癌症相关基因的调节。

为了验证PLUMAGE鉴定的功能性5'-UTR突变，研究团队通过正交定量PCR和荧光素酶测定检测了单个野生型和突变体对。在一些致癌基因中发现了影响转录水平的突变，它们是MAP激酶信号通路的组成部分，可驱动前列腺癌（图4）。此外，研究人员注意到这种特定的突变产生了新的DNA结合位点元件，是致癌MYC蛋白的典型结合基序，且在晚期前列腺癌患者中经常被抑制。以上结果表明，5'-UTR是一个包含影响转录水平的调控元件的动态区域，并证明新启动子元件的产生可以影响转录因子结合和致癌因子的mRNA转录水平。

有趣的是，影响mRNA翻译的57.8%的5'-UTR突变也改变了假定的基于RNA的顺式调节元件（图5a）。通过基因特异性转录水平分析，研究确定AKT3突变导致了蛋白质水平的增加，NUMA1突变降低了蛋白质丰度（图5b）。PLUMAGE的独特功能之一是能够同时监测转录和mRNA翻译水平的变化。因此，PLUMAGE 能够发现超越单一基因表达模式的5'-UTR突变。此外，以上发现证明PLUMAGE在描述体细胞5 '-UTR突变影响癌症相关基因分子结果中的重要效用。

此外，PLUMAGE分析发现，与没有MAP激酶途径5'-UTR突变的患者相比，携带特定基因5'-UTR突变的患者更可能在诊断时出现骨转移，表明前列腺癌患者5'-UTR突变的潜在临床关联，并强调了5'-UTR突变在致癌途径激活和癌症进展中的重要性。

该研究利用全新开发的高通量多重功能基因组分析技术PLUMAGE，在转录和翻译水平描述了前列腺癌中体细胞5'-UTR突变的功能图谱。研究结果显示，5'-UTR突变影响着多种癌症相关途径，这些突变在特定的5'-UTR编码的顺式调节元件中富集。该研究为遗传疾病的多重功能基因组研究提供了数据资源和技术支持。PLUMAGE适用于研究各种基因组区域中的多种突变。作为一种技术资源，PLUMAGE有望帮助开启人类遗传学此前未开发的前沿领域。

参考文献：

Lim, Y., Arora, S., Schuster, S.L. et al. Multiplexed functional genomic analysis of 5’ untranslated region mutations across the spectrum of prostate cancer. Nat Commun 12, 4217 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-24445-6