我国是乙肝大国，肝癌死亡率在我国占恶性肿瘤死亡率的第二位（仅次于肺癌）。在全世界范围内，肝癌是癌症相关死亡的第二大原因，其中肝细胞癌（HCC）占病例的90%。虽然经过长期实验研究，HCC的监测和治疗策略有所进步，但由于高复发率和转移率，HCC的临床治疗结果仍然亟需提升。血源性传播是HCC转移的主要途径，迫切需要深入研究其发生机制以提高肝癌患者的临床疗效。

多项研究表明，循环肿瘤细胞（CTCs）是HCC中肝内和肝外转移（EHM）的“种子”。在传播过程中，CTCs会受到血液微环境施加的多种类型压力，包括失巢凋亡、剪切力、氧气/营养缺乏和免疫监视等，这些压力都必须在癌细胞成功定植之前克服。因此，针对性地研究CTCs及其在血液扩散过程中的变化，有助于发现肿瘤转移的新机制。虽然研究人员借助单细胞RNA测序（scRNA-seq）在CTCs分析研究中取得了相当的进步，但关于CTC传播过程中的转录组可塑性和适应性机制的数据还知之甚少。

近日，复旦大学中山医院樊嘉院士、杨欣荣教授团队合作在Nature Communications发表了题为“Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma”文章。研究团队利用scRNA-seq检测了来自HCC患者4个不同血管部位的113个CTC的单细胞转录组并构建表达图谱，发现CTCs之间存在显著的血管内和血管间部位的异质性。研究发现，CTCs的转录动力学与血液运输过程中的应激反应、细胞周期、免疫逃避信号有关。此外，研究团队还发现趋化因子CCL5是CTC免疫逃避的重要介质，可通过p38MAX信号招募调节性T细胞（Tregs）促进CTCs的免疫逃逸和转移。

该研究收集了10例HCC患者实施根治性切除术前的血液样本，从肝静脉（HV）、外周动脉（PA）、外周静脉（PV）、门静脉（PoV）4个血管部位的样本中分离出295个CTC单细胞，并对符合条件的119个CTC进行scRNA-seq分析，筛选出113个合格CTC。

随后，研究人员通过基因集富集分析（GSEA）确定了CTC中上调的分子途径，包括细胞转移和侵袭、细胞周期、抗细胞凋亡、免疫反应和促凝信号通路。差异表达分析发现，与侵袭性和转移有关的基因，例如ACTB、AMIGO2、S100A4在67%的CTCs中被上调；编码参与能量代谢的基因，包括SLC2A3和PDK1，在大多数CTCs中高度富集；趋化因子信号通路在CTCs中也被上调，包括CCL5、CXCL5和CXCL3（图1）。

研究团队分析10名患者CTCs的t-SNE图发现，从不同血管隔室分离出来的CTCs按患者来源聚集在一起，表明患者间的异质性高于血管隔室的异质性。为进一步探究CTCs在转移过程中的空间转录异质性，研究团队分析了同一患者四个不同血管部位特异性表达的CTC基因谱，发现每个血管部位分别富集了与氧化磷酸化/异生物质代谢（HV）、GPCR信号传导（PA）、免疫反应/细胞因子产生（PV）和细胞周期（PoV）有关的基因。表明CTCs具有明显的血管内和血管间异质性，并且HV CTC异质性最高（图2）。

研究人员对相邻两个关键血管部位的CTC表达谱进行了差异基因分析，发现不同循环部位之间的CTC呈现出转录组的时空动态变化特征。CTC的转录活性在PA中降低，但在PV和PoV中增加。其中最显著的表达变化发生在HV和PA区域之间（图3）。

从HV到PA的过程中，CTC的整体转录活性降低，下调基因富集在细胞生长和增殖等信号通路，以及MYC靶基因和G2/M检查点相关基因；上调基因包括上皮间质转化（EMT）相关基因（如SPARC和IGFBP2）和与肿瘤细胞-血小板微聚集物的形成（如GP1BA和VWF）、免疫抑制性趋化因子有关的基因。上述结果表明，所有生物过程都可能赋予CTC免疫逃避优势，使其在遇到外周细胞毒性免疫细胞时能够存活下来，这对成功的CTC介导的转移至关重要。

为了探究促进CTC免疫逃避能力的关键基因，研究团队分析了免疫逃避相关基因及细胞因子在原发性肿瘤和CTC中的差异表达（图4）。结果显示，免疫抑制趋化因子CCL5在上调表达基因中位列第一，并且在CTC从HV至PA、PV和PoV过程中保持相对较高的表达水平，这一发现也通过IF分析得到验证。

通过对已发表的实验数据进行分析，研究发现，CCL5的表达与HCC肿瘤组织和PoV 肿瘤血栓中的Tregs（FOXP3）呈正相关，并通过TCGA数据集分析证实Treghigh/CCL5+CTChigh是早期复发最强的独立预后因素。此外，体外和体内模型结果表明，CTC可通过CCL5来募集Tregs，从而抑制杀伤性CD8+ T细胞的功能，在转移定植过程中建立有利于其生存的局部微环境。

为确定诱导CCL5表达的关键转录因子（TFs），研究人员在CTCs中筛选了43个与CCL5水平呈正相关的TFs，其中相关性最高的是MYC-associated factor X（MAX）。此外，对 CTCs中上调的基因组进行KEGG分析后发现p38 MAPK信号显著增强，且p38-MAX 信号激活在控制CCL5转录中有着重要作用。

该研究利用scRNA-seq破译了CTCs表达谱，并证实CTC之间的空间转录异质性及转移机制。研究发现，CCL5是CTC免疫逃避的重要调节因子，CCL5在CTC中的过度表达受到p38-MAX 信号的转录调控，p38-MAX 信号通过调节调节Tregs来促进免疫逃逸和CTCs的转移。总而言之，该研究揭示了原发性肝癌的空间异质性和免疫逃逸机制，有助于设计新的抗转移治疗策略。

参考文献：

Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of CTCs by single-cellRNA-seq in hepatocellular carcinoma. Nature Communications.02 July 2021.DOI:10.1038/s41467-021-24386-0