经过大量的测评工作，由伯科自主研发生产的全外显子Panel，TargetCap® Core Exome Panel v3.0，其性能表现得到了众多用户的高度认可，尤其是覆盖均一性方面。如图1所示，在测序500x的情况下，Core Exome Panel v3.0在不同测序平台上都能达到1.4左右的Fold 80。有用户表示，该均一性已经超过诸多国外竞品，大大超出预期。
图1. TargetCap® Core Exome Panel v3.0在高深度测序下的均一性表现。
覆盖均一性是靶向测序最重要的参数之一，它决定了有多少目标区域能够达到分析要求。换言之，高均一性能够减少测序数据量，节约成本（图2A）。如图2B所示，使用伯科TargetCap® Core Exome Panel v3.0进行捕获分别在Illumina和MGI平台测序，在测序7.5Gb时（92/101X），≥20X以上的目标区域占比达到99.6%；5Gb测序时（61/68X）, ≥20X以上的目标区域占比仍然超过98%，远高于国标《GB/T 37872-2019》规定的80%。
图2. 高均一性可有效节约测序数据量。
那么，如此优秀的均一性是怎么做到的呢？接下来，小编和大家聊一聊TargetCap® Core Exome Panel v3.0的开发中用到的一些“黑科技“。
影响覆盖均一性的因素有很多，其中目标区域GC含量最为关键，通过对低/高GC区域的局部探针浓度调整可以优化Panel的覆盖偏好。但除了GC含量，还有一个鲜为人知的关键因素——探针补偿效应。伯科研发团队对引起覆盖偏好的因素进行聚类分析时发现，目标区域所覆盖的探针数量的多少与其覆盖深度正相关，也就是说探针之间的侧翼补偿效应会引起覆盖偏好，其原理如图3所示。
图3. 探针侧翼补偿效应产生覆盖偏好示意图。
按照目标区域覆盖探针数量的多少，伯科团队把目标区域分为低、中、高补偿区（L-FLK、M-FLK和H-FLK），以及低，中，高GC区域分别对~1.5万条探针组成的Panel进行统计，如图4所示。目标区域的覆盖深度与其探针数量正相关，也就是说，长短不一的目标区域会因为覆盖探针的多少产生天然的深度差异，其与GC偏好一样，是影响Panel覆盖的重要因素。
图4. GC含量和探针补偿效应对覆盖深度的影响。
那么，调整L/M/H-FLK这3种区域的局部探针浓度，能否改善Panel的覆盖偏好呢？为验证这一假设，研发人员合成了L/M/H-FLK区域探针不同浓度配比的Panel，并进行捕获测序。如图5所示，浓度配比2#的三个区域之间的覆盖差异最小，数据表现最优，与比例1#相比，Fold 80降低0.1（SNP等位基因频率并未受到影响），证明探针补偿效应也是影响覆盖均一性的重要因素，调节补偿效应区域探针浓度是优化Panel均一性的有效手段。
图5. 调整不同探针补偿区的探针配比对覆盖均一性的影响。
在此基础之上，对GC偏好区域的探针局部浓度进行调整，也能使Fold80降低0.1，进一步表明探针补偿效应是独立于GC的覆盖偏好影响因子（图6）。
图6. 调整不同GC含量目标区域探针配比对覆盖均一性的影响。
综上所述，针对覆盖偏好的关键影响因子探针补偿效应和GC含量，调整对应的探针浓度，可以明显改善Panel的覆盖均一性（图7）。
图7. 由伯科生物自主研发的覆盖偏好优化技术原理示意图。
在WES Panel的开发过程中，除了使用伯科独创的局部探针浓度调整技术，TargetCap® Core Exome Panel v3.0还采用伯科自主知识产权的专利生物素修饰。分别采用伯科生物素与常规生物素分别制备Core Exome Panel v3.0，并进行捕获测序。结果显示，与常规生物素相比，伯科生物素能够进一步提升覆盖均一性（图8）。除此之外，通过加入多种小分子化合物，伯科自主研发的杂交试剂能够进一步降低GC偏好。
图8. 伯科生物素与常规生物素修饰的Core Exome Panel v3.0比较。
综上所述，从杂交试剂、探针修饰/合成/设计、探针局部浓度调整等多方面测试优化调整，所谓“积跬步至千里“，每一步1%的提升积累，使得TargetCap® Core Exome Panel v3.0的覆盖均一性在众多竞品中脱颖而出。同时，伯科将继续努力，打磨技术，精益求精。
伯科生物科技有限公司（以下简称“伯科”）是国家高新技术企业，在中国无锡已经搭建了全流程国产化的高通量核酸合成与应用技术转化中心；拥有GMP级别的洁净厂房。随着精准医疗的快速发展以及基因测序技术的市场成熟，生物液相基因捕获芯片（Gene Panel）已经成为了合成生物学的重要应用之一，在生殖、遗传疾病、肿瘤诊断、肿瘤早筛、病原体检测等医学与健康领域有着广泛的应用空间，同时在动植物育种的优化筛选与检测方面有广阔的应用场景。
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2020年伯科入选江苏省"双创人才"，无锡市"太湖人才计划创业领军人才"。
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