近年来，基于新一代测序技术的ChIP-seq（Chromatin Immunoprecipitation sequencing）技术能够真实反应靶蛋白在全基因组上的结合情况，是非常经典的DNA结合位点分析方法，在生物医学研究领域被广泛使用。但由于ChIP-seq所需的起始细胞量较大，这在一定程度上限制了其对少量细胞或者是稀有细胞类型的研究。此外，ChIP-seq数据分析中信噪比低，其中的很多非特异信号只能通过更高的测序数据量才能够减弱。与此同时，实验的打断条件、重复性差等均使得ChIP-seq对新手非常不友好，需要经过长时间的预实验才能得到满意的结果。

为了克服上述难题，2019年4月，美国弗雷德哈钦森癌症研究中心 Steven Henikoff 研究团队首次报道了一种新兴的蛋白质-DNA互作研究方法——CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation, CUT&Tag），并在Nature Communications在线发表了题为“CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells”的研究性文章，公开了技术的详细结果与实验方案。

CUT&Tag技术利用一抗靶向结合目的蛋白，二抗孵育放大信号，创新性的pA-Tn5融合蛋白与一抗和二抗中的Fc区结合，Mg²⁺激活Tn5酶活性后切割目标区域并加上接头，随后提取的DNA经过PCR扩增后获得测序文库。由于CUT&Tag免去了甲醛交联和超声破碎，并且简化了建库流程，因此在节省初始实验材料的同时，又提高了信噪比以及实验重复性。此外，CUT&Tag在识别染色质特征时最高效，并能对极少量细胞甚至单细胞进行分析，极大地拓展了蛋白质-DNA互作领域的研究范围。

图1. CUT&Tag实验流程图。

文章发表在Genome Biology

研究团队借助三代测序平台（PacBio RS II）获取了约30G的高质量、高保真序列数据，并通过生物信息学方法组装获得大刺鳅的基因组序列，发现其可独立产生两个染色体水平的单倍体基因组hap-X和hap-Y，两个基因组之间的gap数存在差异。

图2. 单倍体型解决染色体水平组装。

随后，研究团队根据更加精细的细胞遗传学检测，发现大刺鳅二倍体的48（2n）条染色体中5对为中着丝粒染色体、3对为亚中着丝粒染色体和16对为端着丝粒染色体。对雌雄各10例个体进行重测序分析，并对与性别相关的变异进行鉴别和筛选。结果发现，与假常染色体区（PAR）或常染色体相比，Y染色体上的~7 Mb性连锁区（sex-linked region，SLR）序列显示出高密度的雄性特异性突变。大部分SLR在X和Y染色体上都有高密度的重复序列，性染色体对的整个短臂，包括X和Y染色体的着丝粒区域，具有异染色质的典型特征，包含大量的H3K9me3修饰。由于短臂异染色质位于着丝粒附近，因此，研究人员推测短臂异染色质可能起源于着丝粒周围异染色质（PCH）。

图3. 年轻的性染色体的研究。

最后，研究人员还探讨了常染色体是否也存在类似性染色体中的大着丝粒周围区域。分析结果显示，常染色体着丝粒周围的区域（~4 Mb）同样具有较高的重复序列（通常高于50%）、较低的基因密度、较低的重组率和更频繁的H3k9me3修饰。此外，在常染色体着丝粒周围区域，距离较远的染色质互作会更频繁，这也符合其基因组折叠和压缩的特征。但着丝粒周围区域比其他区域有更大比例的高表达水平和宽度的基因，这与先前的观点一致，即H3K9me3在基因抑制中的作用有限，并且可能存在其他表观遗传修饰调节PCH中的基因表达。

图4. 广泛的着丝粒周围异染色质区。

综上所述，该研究结合三代测序和HiFi数据，从染色体层面上有效地组装大刺鳅单倍型基因组，并在此基础上对基因组信息进行了深入分析。结果表明，大刺鳅基因组包含大多数染色体的亚端粒和着丝粒周围异染色质序列，包括X和Y染色体。SLR位于着丝粒周围区域，表明祖先的低重组区域可以产生SLR而不依赖于对重组抑制的自然选择。

参考资料：

3.Cortez D, Marin R, Toledo-Flores D, Froidevaux L, Liechti A, Waters PD, et al. Origins and functional evolution of Y chromosomes across mammals. Nature. 2014;508(7497):488–93. https://doi.org/10.1038/nature13151.