近年来，单细胞基因组学成为热点，由于蛋白无法如基因一样扩增，使得单细胞蛋白质组学更具挑战。单细胞蛋白质测序技术是利用DNA条形码标记细胞内和细胞表面分子，能够同时有效地分析数千个细胞的分子特征。与流式细胞术或质谱仪相比，单细胞蛋白质测序具有以下优点：一、可将整个细胞表面蛋白作为靶点，开发数百种商业化的抗体panel，而流式细胞术的靶蛋白数量受荧光团发射光谱重叠或金属同位素数量（约50种）的限制。二、只需通过一次测序便能轻松读取所有抗体衍生标签（ADT），无需多轮信号分离和检测，从而大大减少分析大型panel的时间和样本输入。三、可以从同一细胞中分析更多分子，实现细胞的多模式分析。四、可以使用额外的DNA条形码编码正交信息，为临床应用创造机会，并使用自然变量、合成序列或单指导RNA对细胞进行编码。该测序技术主要限制是基于微流控的建库成本高，因此无法用于表型群体队列或大规模筛选。

单细胞组合索引（SCI）测序是微流控的替代方法，可实现大规模并行单细胞测序。近期一项研究证明，使用SCI测序可进行表面蛋白分析。标准SCI测序需要两轮以上的组合索引来分析不超过105个细胞。但结合多轮化学和酶反应以确保DNA条形码抗体在每轮测序过程中保持与表面蛋白质结合在一起具有挑战性。

近日，来自加利福尼亚大学的Chun Jimmie Ye研究团队开发了一种用于单细胞蛋白质和多模式分析的超高通量平台——SCITO-seq。SCITO-seq利用微流控技术，使用夹板寡核苷酸（oligos）从每个反应中提取超过105个细胞的DNA条形码抗体，实现组合索引的单细胞测序。研究结果表明，SCITO-seq可同时对来自同一细胞的转录组和表面蛋白质进行表达谱分析，获得的细胞组成和表面蛋白表达的可重复性与质谱仪相当。因此SCITO-seq是一种简单且经济高效的超高通量平台，可用于基于测序的单细胞蛋白质和多模式分析。该研究成果发表在Nature Methods，文章题为“SCITO-seq: single-cell combinatorial indexed cytometry sequencing”。

SCITO-seq使用DNA标记抗体和微流控液滴组合索引单个细胞，可实现细胞表面蛋白质分析，每个微流控通道可扩展到十万到百万个细胞（图1a）。SCITO-seq可扩展性的关键在于认识到泊松加载限制了液滴内的细胞数量，因此，使用少量抗体池对细胞进行索引将足以确保组合索引以低碰撞率解析细胞，将大大降低库准备成本（与标准的基于测序的单细胞蛋白质分析相比，384个池实现了最大12倍的成本降低）。

研究团队评估了SCITO-seq的敏感性和动态范围，方法是对来自同一供体的两个PBMC池进行分析。结果表明，SCITO-seq在四个数量级的动态范围内具有与流式细胞术相似的噪声分布，池间变化很小。

为证明SCITO-seq在使用表面蛋白进行超高通量多维细胞表型分析中的适用性，研究团队使用10个池中28个单克隆抗体对来自两个健康供体的PBMC进行了分析。结果获得49510个过滤后包含细胞的液滴（CCD，图2a），产生了17个不同的聚类：髓系8个聚类、幼稚和记忆性CD4+和CD8+T细胞、自然杀伤（NK）细胞，B细胞和γδT细胞（gdT，图2b）。随后，研究人员通过比较包含单个SCITO-seq池条形码（单集）和包含多个池条形码（多集）的CCD获得的成分估计值，评估SCITO-seq定量免疫表型的准确性。结果显示，源自单集或多集的解析细胞的统一流形逼近与投影（UMAP）预测在质量上相似（图2c），表明较高的封装率不会产生技术伪影，16个免疫群体的频率估计值与同一供体更为相似（图2d）。

图2.使用SCITO-seq对健康对照组进行超高通量PBMC分析。来源：Nature Methods

为了进一步证明SCITO-seq的灵活性和可扩展性以及检测到的标记物数量，研究团队使用60-plex抗体panel和商用TotalSeq-C（TSC）165-plex抗体panel评估了SCITO-seq的性能。在60-plex实验中，以18.7%的碰撞率恢复了69733个CCD并解析了219063个细胞（图3a,b）。在TSC实验中，恢复了66774个CCD，并以14.1%的碰撞率解析了203838个细胞（图3c,d），并比较了60-plex和165-plex实验之间的成分和表面表达变化。结果表明，SCITO-seq既可以捕获从整个标记panel估计的成分的个体间变异性，也可以捕获通常不作为不同UMAP簇出现的个体表面蛋白的表达。

图3.扩展SCITO-seq以兼容60-plex和165-plex商业抗体panel。来源：Nature Methods

最后，研究团队试图通过整合SCITO-seq和最近发表的Scfi RNA-seq 工作流，实现转录组和表面蛋白质的超高通量多模式分析。Scfi RNA-seq通过池特异性逆转录引物原位逆转录，然后使用10x单细胞ATAC-seq试剂盒（scATAC-seq）将池条形码互补DNA分子与DBC连接，对mRNA进行组合索引。为实现多模式分析，研究人员修改了SCITO-seq夹板寡核苷酸的方向，并设计了一个正交桥寡核苷酸，以协助捕获SCITO-seq ADTs并将其连接到10x scATAC-seq凝胶珠捕获序列（图4a）。

利用抗体对四种人类细胞系和一种小鼠细胞系的混合物种进行染色，抗体与五个池中针对六种表面蛋白的改良SCITO-seq寡核苷酸杂交（图4a）。然后使用Scfi RNA seq工作流处理30000个染色细胞。结果表明，该方法在解析两种模式时具有高信噪比（图4b,c）。为了进一步评估转录组学和ADT数据的一致性，研究人员使用mRNA数据构建了UMAP，并覆盖了ADT簇注释。定量确认包括mRNA和ADT数据之间NK-92细胞的重叠（图4g）。结果表明，SCITO-seq与Scfi RNA-seq的临时整合具有超高通量多模式分析来自同一细胞的RNA和蛋白质的潜力。

图4.整合SCITO-seq和Scfi RNA-seq以同时分析转录物和表面蛋白质。来源：Nature Methods

总的来说，SCITO-seq是一种简单的两轮组合索引方法，能够在单个微流控反应中对超过105个细胞中150个以上的表面蛋白质进行分析。SCITO-seq由于使用微流体细胞负载的自然有限稀释，呈现出两个明显的优势：最小化背景噪声，最小化库准备成本。SCITO-seq可用于群体规模表型的分析，也可拓展使用商业化抗体，还可修改为与许多化学物质兼容，以进一步支持SCITO-seq用于多模式分析。此外，SCITO-seq提供的可扩展性允许对数百万细胞进行大规模分析，例如如带有条形码干扰的混合干扰筛选、大规模人群和疾病队列中的单细胞细胞细胞术，以及克隆进化的免疫谱和表型研究。

参考资料：

SCITO-seq: single-cell combinatorial indexed cytometry sequencing. Nature Methods, doi: 10.1038/s41587-021-00988-3