由DNA甲基转移酶催化的DNA修饰是原核生物和真核生物基因组中最丰富的表观遗传修饰形式之一。分析基因组甲基化模式可以深入了解驱动基因组进化的选择压力。细菌基因组最常见的DNA甲基化有5-甲基胞嘧啶（m5C）、N4-甲基胞嘧啶（m4C）和N6-甲基腺嘌呤（m6A）。细菌的甲基化倾向于在整个基因组的特定位点组成性存在。这些位点由甲基化酶特异性定义。甲基化酶是位点特异性的，靶序列因生物而异。

高通量方法，例如亚硫酸氢盐测序，可以在碱基分辨率下识别m5C，但需要专门的文库制备，单分子实时（SMRT）测序通常会错过m5C。MFRE-Seq利用依赖于修饰的核酸内切酶在甲基化位点产生双链DNA断裂，从而可以鉴定m5C，但无法提供来自单个实验的双重原始序列和甲基化reads。

近日，New England Biolabs公司的Laurence Ettwiller研究团队开发了一种甲基化酶特异性快速鉴定新方法—RIMS-seq，可对细菌基因组进行测序的同时，确定m5C基化酶特异性。该研究成果已发表在Nucleic Acids Research上，文章题为“Rapid identification of methylase specificity （RIMS-seq） jointly identifies methylated motifs and generates shotgun sequencing of bacterial genomes”

文章发表在Nucleic Acids Research上  

图1.RIMS-seq原理。来源：Nucleic Acids Research

该研究团队开发了一种称为RIMS-seq的新方法。该方法使用与标准Illumina DNA-seq非常相似的方案，同时对细菌基因组进行测序并全局分析m5C甲基化酶特异性，且只需一个额外的步骤。数据显示，RIMS-seq呈现出与DNA-seq相当的测序质量，并能准确识别甲基化酶特异性。将RIMS-seq de novo应用于特征菌株或新分离株，无需参考基因组即可识别新活性，并可以与标准鸟枪测序相当的指标组装细菌基因组。

胞嘧啶（C）自发脱氨基导致尿嘧啶（U）和m5C自发脱氨基导致胸腺嘧啶（T）是DNA中常见损伤的例子。研究团队首先评估了最大化m5C脱氨基同时最小化其他DNA损伤的条件（图1C）。与 DNA-seq相比，在RIMS-seq中可以观察到G到C和T到C reads变异的轻微升高，但这种损害频率较低，因此预计不会显著影响RIMS-seq的测序性能QC。研究人员对所有碱性热处理条件进行了 Xp12的QC指标和组装，包括对照DNA-seq。根据插入片段大小、GC偏向性和基因组覆盖率评估整体测序性能。在所有处理时间在 RIMS-seq和DNA-seq对照之间观察到类似的结果，表明RIMS-seq热-碱处理不会影响文库的质量。

研究团队还评估了与Xp12参考基因组相比的组装质量，发现热-碱处理不影响组装质量，提高了使用RIMS-seq同时进行基因组从头组装和甲基化酶特异性鉴定的可能性。结果发现，3小时的热碱处理在脱氨基速率和实验持续时间之间提供了良好的折中。同时发现更长的孵育时间（最多14小时）将脱氨率提高了1%，但与所需的额外实验时间相比，仅是略微增加了灵敏度。

图2. 热碱脱氨步骤的优化。来源：Nucleic Acids Research

为了验证RIMS-seq在细菌基因组中的应用，研究团队对过表达甲基化酶基因（K12）和无甲基化酶基因（BL21）的大肠杆菌进行了测序，并进行了与标准DNA-seq相对应的对照实验。对照DNA-seq实验显示正向测序reads（R1）和反向测序reads（R2）之间的C到T reads变异的数量相当。在RISM-seq中，热碱处理使K12的C到Treads变异增加了4倍（图2A），但对BL21无影响。这种C到T reads变异升高对经过热碱处理的大肠杆菌K12菌株具有特异性，表明RIMS-seq能够区分大肠杆菌中的甲基化和非甲基化序列。

图3. RIMS-seq能够区分大肠杆菌中的甲基化和非甲基化序列。来源：Nucleic Acids Research

为了让RIMS-seq从头识别甲基化酶特异性，研究团队设计了一个基于MoSDi的分析框架——RIMS-seq-de-novo motif，以找到在R1 reads中C到T转换周围过度表达的序列（图3A）。将RIMS-seqreads映射到钙醋酸不动杆菌的组装，使用RIMS-seq-de-novo motif分析。在映射到参考基因组时发现的相同序列也存在于钙醋酸不动杆菌de novo组装中，具有相似的意义（图3C）。这些序列对应于该菌株中预期的甲基化酶特异性，表明RIMS-seq可用于任何细菌的基因组测序和组装，无需参考基因组。

图4. RIMS-seq在大肠杆菌K12中从头识别正确的甲基化酶特异性。来源：Nucleic Acids Research

研究团队评估了RIMS-seq是否可以应用于来自ATCC（分别含有12种和6种细菌）的合成肠道和皮肤微生物组的混合微生物群落。他们将 RIMS-seq测序性能与DNA-seq和亚硫酸氢盐测序进行了比较，发现DNA-seq和RIMS-seq之间的物种丰度相似，表明RIMS-seq可用于定量估计微生物组成。具体而言，使用RIMS-seq，他们发现了12种肠道微生物组中的6种和6种皮肤微生物组中的5种的序列。在皮肤群落中发现了来自藤黄微球菌的未知回文序列GG C SGCC（S 为C或G），显示了RIMS-seq鉴定新甲基化酶特异性的潜力。另外，亚硫酸氢盐-seq 结果表明来自ATCC合成皮肤微生物组的约氏不动杆菌和缓和链球菌中的ACGT序列未完全甲基化（图4B）。约氏不动杆菌中的大多数位点显示约10%的甲基化，而在缓和链球菌中，每个位点的平均甲基化为23%（图4C）。这些结果强调，尽管甲基化水平低，RIMS-seq依然能检测到。

图5. RIMS-seq可应用于微生物群落。来源：Nucleic Acids Research

综上所述，RIMS-seq可利用单次文库制备同时获得高质量的基因组序列，并发现细菌中的m5C甲基化酶特异性。该技术的简单性使其成为一种经济高效且省时的方法，且显示出与DNA-seq相似的测序指标，因此RIMS-seq有潜力替代DNA-seq进行微生物研究。