随着成本持续下降，越来越多的研究人员和临床医生正在使用下一代测序（NGS）技术检测癌症突变。精准肿瘤学的临床应用需要准确的测序，进而将真正的癌症特异性突变与NGS测序步骤中引入的错误区分开来。此外，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本常被用于提取DNA，但由于临床样本中的肿瘤纯度不一，对测序仪器和分析工具提出了挑战。

目前，已有部分研究根据突变检测的准确性和一致性对生物信息学流程/检测方法，以及分析开发、文库制备和生物样本资源等其他步骤进行了比较。但迄今为止，还没有批量测序研究如何解决跨位点可重复性的影响，也没有解决影响变异识别的生物学、技术和计算因素。

近日，复旦大学石乐明教授团队与洛马琳达大学医学院Charles Wang教授以及美国食品药品监督管理局Huixiao Hong博士和Wenming Xiao博士合作，聚焦如何开发精准肿瘤医学临床应用的可靠检测方法，从而真正发现有意义的癌症特异性突变而非新一代测序流程中各环节可能引发的技术误差。研究团队开发了一种使用代表性细胞系参考样本和数据集评估NGS性能的系统方案，并在Nature Biotechnology杂志上发表了题为“Toward best practice in cancer mutation detection with whole-genome and whole-exome sequencing”的文章。

为了在基于NGS的肿瘤分析工作流程中检测每个变量的影响，研究团队设计了包括不同生物样本类型、样本量、肿瘤纯度和文库制备方法，以及不同的Illumina测序仪器、测序中心和生物信息学分析方法的一整套系统方案。结果发现，覆盖率和突变检测方法可影响全基因组测序（WGS）和全外显子组测序（WES）的可重复性，WES性能还受插入片段大小、基因组拷贝和基因组全局不平衡评分（GIV）的影响。此外，该研究还介绍了一项具有可操作性的方案，以提高 NGS癌症突变检测实验的可重复性和准确性。

为了查明影响检测体细胞变异的因素，研究团队选择了一对匹配的乳腺癌细胞系进行分析。WGS在六个测序中心（诺华，NV；Illumina，IL；复旦大学，FD；欧洲转化医学基础设施，EA；国家癌症研究所，NC；洛马琳达大学，LL），三个测序平台（HiSeq 4000，HiSeq X10 和 NovaSeq S6000）进行。每个样本的测序结果在各中心和平台都存在差异，诺华的覆盖率始终高于其他中心（图1b）。

GIV是DNA损伤的常用指标，因此可用于监测NGS运行中的DNA质量。研究团队在癌细胞系的WES数据中观察到高GIV评分，在FFPE样本的WGS数据中观察到“剂量依赖性GIV失衡”（图1d）。因此，WGS比WES更适合用于FFPE样本检测。

图1. 实验设计和测序质量。来源：Nature Biotechnology

此外，肿瘤的纯度和覆盖率也会影响检测工具的表现，更高的覆盖率可检测到更多的SNV（图4d）。当肿瘤纯度较低（<50%）时，检测对测序深度更为敏感。为了测试检测工具在低肿瘤纯度样本上的表现，研究团队将WGS三次重复运行的reads汇集在100倍覆盖率的样本上，在每个细胞系上产生200倍或300倍的覆盖率。除了该研究中使用的三个主要检测工具外，还加入了另外两个工具：TNscope和Lancet。结果显示，当肿瘤纯度为20%或更低时，提升覆盖率的好处显而易见（图4d）。另一方面，SomaticSniper在任何肿瘤纯度水平上的表现都较差，增加覆盖率并不能挽救其表现。这些结果表明，肿瘤纯度对突变检测的影响比覆盖率更大。