下一代测序技术的发展加速了循环肿瘤DNA（ctDNA）分析的临床应用。许多低肿瘤突变负荷患者诊断依赖于在更丰富的无细胞DNA（cfDNA）片段库中精确检测微小水平的ctDNA。低水平ctDNA检测/分析的进一步改进将对未来癌症诊断的筛查、预测和病情监测产生巨大影响。

由致癌病毒引起的癌症，例如宫颈癌和口咽癌等人乳头瘤病毒（HPV）相关癌症，约占全球癌症负担的13%。在这类癌症中，病毒基因组可以用来区分ctDNA和其他细胞来源的cfDNA。但大多数研究都是通过定量或数字聚合酶链反应（qPCR或dPCR）检测ctDNA，但这些方法尚不能实现稳健的低水平ctDNA定量。

近日，大学医疗网络（The University Health Network，UHN）的Scott V. Bratman研究团队开发了一个优化的HPV病毒基因组杂交捕获测序方法——HPV-seq，在Clinical Cancer Research上发表了题为“HPV sequencing facilitates ultrasensitive detection of HPV circulating tumor DNA”的研究文章。为评估HPV-seq能否在低肿瘤突变负荷中对HPV ctDNA进行准确定量与定性，研究团队将HPV-seq应用于局部晚期宫颈癌或口咽癌患者，证明了其在检测<1拷贝的ctDNA中的性能，实现了HPV特异性ctDNA的灵敏检测。研究结果表明，HPV-seq是一种ctDNA定量检测方法，性能优于dPCR，并能揭示ctDNA的定性信息。

研究团队首先确定了捕获HPV基因组文库的最佳条件，对检未结合文库进行了检测。使用相同的单链诱饵（正诱饵）对未结合的文库进行一轮捕获对总目标回收率的影响较小（图1b-c），表明捕获反应已接近饱和。在第二轮捕获中，用正诱饵代替交错反义诱饵（负诱饵）可显著提高目标序列的富集程度。当正和负诱饵在一次捕获反应中全部结合时，这种效果得以维持。基于这些结果，双链杂交捕获可以改进标准的文库富集方案，以实现稳健的ctDNA检测。

图1. HPV-seq和双链杂交捕获概述。来源: Clinical Cancer Research

建立HPV-seq混合捕获方法后，研究团队还评估了HPV-seq的分析灵敏度和检测下限（LLOD）。结果显示，带有双链全长病毒捕获的HPV-seq能够检测到0.01%和0.003%的SiHa DNA，分别对应于0.6和0.2个拷贝，表明在<1个拷贝时存在稳健的LLOD。通过对HPV-seq的测序读取进行二次抽样，评估200 bp、1600 bp或全长7904 bp HPV-16基因组的reads图谱。正如预期的那样，HPV-16基因组的诱饵长度增加了检测HPV的可能性，提高了分析灵敏度。以上结果显示了双链全长病毒捕获对HPV超灵敏检测的影响。

图2. HPV-seq的分析敏感性。来源：Clinical Cancer Research

子宫颈癌是几种常见的HPV相关癌症类型之一。研究团队分析了HPV-seq在HPV基因分型中的表现。该分析通过将HPV基因分型panel应用于可用的治疗前宫颈癌血浆样本，并与dPCR的结果进行比较。分析显示，超过99.7%的HPV的reads被分配到相应肿瘤组织中观察到的相同HPV基因型。值得注意的是，即使是ctDNA水平相对较低的样本，也可以进行基因分型。此外，在dPCR检测失败的一个样本中，HPV-seq也能进行基因分型（图3a）。研究团队还评估了HPV-seq诊断宫颈癌的敏感性和准确度。结果显示，HPV-seq与dPCR、HPV ctDNA水平高度相关（图3b）。

图3. 使用HPV-seq从血浆cfDNA中进行HPV基因分型和ctDNA定量。来源: Clinical Cancer Research

该研究中的17名宫颈癌患者中有4名出现了癌症复发。研究人员通过HPV-seq对所有患者的治疗结束时间点进行了分析。与未复发的12名患者相比，该4名患者在治疗结束时的HPV ctDNA水平显著升高（图4a）。中位随访27.5个月，治疗结束时检测到的HPV ctDNA与无进展生存率低相关（图4b）。HPV-seq预测治疗结束时复发的敏感性和特异性分别为100%和67%。

图4. 治疗结束时可检测到的HPV ctDNA与疾病复发相关。来源: Clinical Cancer Research

最后，研究团队比较了HPV定位ctDNA片段长度与使用全长病毒捕获HPV-seq分析的宫颈癌样本的人类定位cfDNA片段。结果显示，HPV ctDNA显示的中位数片段大小为146 bp，比人类定位cfDNA的中位数片段大小短22 bp（图5a）。值得注意的是，在复发时采集的样本（图5b）以及未复发患者采集的样本（图5c）中也发现了类似的结果。无论HPV基因型如何，中位HPV ctDNA片段长度均短于人类定位cfDNA（图5d-f）。以上结果表明了使用HPV-seq对ctDNA片段进行定性分析的强大能力。

图5. 13例宫颈癌患者人类定位cfDNA和HPV定位ctDNA片段的长度分布。来源：Clinical Cancer Research

该研究结果表明，HPV-seq能够对宫颈癌和口咽癌ctDNA进行超灵敏检测和定性分析，或将对HPV相关癌症的治疗及监测产生影响，为HPV ctDNA分析的潜在临床应用（例如癌症早期检测和最小残留检测）提供新的思路。

参考文献：

Leung E, Han K, Zou J, Zhao Z, Zheng Y, Wang TT, Rostami A, Siu LL, Pugh TJ, Bratman SV. HPV sequencing facilitates ultrasensitive detection of HPV circulating tumor DNA. Clin Cancer Res. 2021 Sep 27:clincanres.2384.2019. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-19-2384. Epub ahead of print. PMID: 34580115.