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Nature Biotechnology | Genentech公司开发TraCe-seq系统用于识别癌症药物反应的转录特征

导 读

针对致癌驱动基因突变的靶向治疗为癌症患者提供了显著的临床获益,为精准医疗带来了巨大的希望。但并非所有癌症患者都能产生治疗反应,其他既存的和获得的耐药机制对患者的整体反应和药效持久性提出了巨大的挑战。近年来,靶向蛋白降解这一新的作用机制 (MOA) 引起了人们的广泛关注。与传统的基于占位的靶向抑制不同,异质双功能靶向蛋白降解物能够同时将E3泛素连接酶富集到目标位置,并通过泛素介导的蛋白质水解诱导靶向降解的分子,并被证明在特定情况下优于单独的酶抑制。但目前尚不清楚双作用抑制剂-降解剂是否具有普遍优势。

为了解决上述难题,美国Genentech公司研究团队开发了一个名为TraCe-seq (Tracking differential clonal response by scRNA-seq) 的系统,能够同时跟踪肿瘤起源并比较肿瘤细胞对不同疗法的即时反应,大大加速药物反应机制或者耐药机制的研究。近日,这一研究成果以“Identifying transcriptional programs underlying cancer drug response with TraCe-seq”为题在线发表在Nature Biotechnology图片

文章发表在Nature Biotechnology 

研究团队证明,该系统可以在亚群和单细胞分辨率下直接全面地比较不同的治疗方式,并解析决定药物反应和耐药性预先存在的转录特征,使得直接比较不同疗法的疗效和MOA成为可能,从而加速未来肿瘤疗法的发展。

主要研究内容

为了开发TraCe-seq,研究团队构建了一个与3'端单细胞转录组测序(scRNA-seq)兼容的基于慢病毒的条形码库。每个条形码30个核苷酸组成,具有10万多种不同的组合。此外,研究人员还设计了一个8核苷酸大小的子库索引,以灵活控制总库大小。成功转导后,慢病毒载体将稳定整合到基因组中,使选择性标记、嘌呤霉素抗性和增强型绿色荧光蛋白 (eGFP) 的组成型表达。

图1. TraCe-seq构建和作用模式图。图片来源:Nature Biotechnology 

1.TraCe-seq捕获了双重EGFR抑制剂-降解剂的较差活性

EGFR靶向治疗是精准肿瘤治疗的代表性方法之一,因此,研究人员试图使用TraCe-seq来更好地了解EGFR发挥疗效的独特MOAs。虽然靶向EGFR的小分子策略专注于抑制其酶活性,但相对于酶抑制,对EGFR降解的潜在结果知之甚少。为此,研究团队开发了GNE-104,一个由EGFR抑制剂厄洛替尼组成的异源双功能降解物。

为了进行TraCe-seq实验,研究团队随机选取600个携带独特条形码的PC9细胞,将这些细胞扩增12倍,对部分细胞进行了约30倍条形码覆盖率的单细胞转录测序分析,以记录基线转录特征和相对克隆丰度。数据分析结果显示,GNE-104处理在减少TraCe-seq条形码的绝对数量和多样性方面效果较差。此外,虽然在所有处理条件下均观察到类似的MAPK通路抑制,但厄洛替尼和GNE-069诱导的细胞周期阻滞远远大于GNE-104,表明GNE-104处理允许更多的细胞在MAPK通路抑制的情况下持续存在

图2. 双重EGFR抑制剂-降解剂较差的疗效。图片来源:Nature Biotechnology 

2.TraCe-seq揭示了双重EGFR抑制剂-降解剂的不同转录反应和耐药机制

为了进一步了解PC9细胞在克隆水平上对这些处理的不同反应,研究团队将TraCe-seq条形码进行分类,发现TraCe-seq条形码在治疗群体中比未治疗群体的比例高,并被分为三类耐药克隆。特别地,与激酶抑制剂治疗相比,GNE-104治疗导致了一组独特的TraCe-seq条形码的过度表达,这被归类为抗降解的特性。 图片

图3. TraCe-seq揭示了不同类型的耐药克隆。图片来源:Nature Biotechnology 

研究人员探索了药物敏感克隆与耐药克隆在基线状态下的基因表达差异。激酶抑制剂耐药克隆与敏感克隆之间的基线基因表达比较结果发现,在治疗前,激酶抑制剂耐药细胞中的VIM和AXL显著上调,证实了TraCe-seq能够成功捕获预期的耐药亚群体和相关的分子标记。抗降解克隆仅表现出AXL的表达升高,没有表现出VIM的上调,表明它们确实在转录上与激酶抑制剂抗性克隆不同。此外,在这些耐降解克隆中,与GNE-104治疗相比,厄洛替尼治疗诱导的内质网途径的蛋白质加工是最丰富和最重要的途径

图4.基于转录组的不同演化路径的分析。图片来源:Nature Biotechnology 

3.内质网应激程序的缺失增强了EGFR小分子抑制剂的细胞毒性活性

为了进一步验证内质网应激在EGFR激酶抑制剂疗效中的作用,研究人员利用实验抑制剂ISRIB特异性阻断内质网应激下游的前死亡基因的过度激活。在PC9和NCI-H1975细胞中,ISRIB处理确实钝化了由EGFR激酶抑制剂诱导的ATF4、DDIT3和PPP1R15A的激活,并降低了细胞杀伤疗效。相反,在极低的无毒浓度下,添加内质网应激诱导剂则可极大地诱导了内质网应激基因的表达,并增强了降解剂GNE-104在PC9细胞中的细胞毒活性

图6. 内质网应激-ISR轴的药理学调节改变抗EGFR小分子的疗效。图片来源:Nature Biotechnology 

结 语

综上所述,TraCe-seq平台能够识别影响不同治疗结果的既有和自适应转录特征。通过追踪暴露于不同的EGFR靶向治疗后有反应和持续存在的细胞,并进行差异基因分析和假时序轨迹比较,研究团队发现了不同MOAs的EGFR靶向药物的细胞机制之间的差异,揭示了EGFR抑制剂反应中一个令人兴奋且此前未被重视的部分:由于抑制结合的EGFR而诱导内质网应激是实现充分疗效的关键。

参考文献
1. Chang, M.T., Shanahan, F., Nguyen, T.T.T. et al. Identifying transcriptional programs underlying cancer drug response with TraCe-seq. Nat Biotechnol (2021).
2. Kobayashi, S. et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 352, 786–792 (2005).
3. Davies, A. H., Beltran, H. & Zoubeidi, A. Cellular plasticity and the neuroendocrine phenotype in prostate cancer. Nat. Rev. Urol. 15, 271–286 (2018).
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本文由 SEQ.CN 作者:白云 发表,转载请注明来源!

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