非聚腺苷酸化RNA-seq流程主要应用于原核mRNA、FFPE样品中的片段化mRNA等。针对以上所述种类的RNA-seq，其主要问题在于如何消除核糖体RNA（rRNA），这也是细胞中含量最丰富、少有关注的RNA种类。 去除提取样本总RNA中的rRNA的方法包括：(1)基于可以与rRNA序列杂交的序列特异性探针，经过与生物素标记的DNA或锁核酸（LNA）探针杂交，使用链霉亲和素磁珠将其去除；(2)设计与rRNA序列互补的反义DNA寡核苷酸，之后使用RNase H酶进行消化。

在常规的RNA-Seq文库制备流程中，直接使用随机六聚体引物扩增生成的双链cDNA为模版进行文库制备，虽然简单可行，但却丢失了RNA水平上的链特异性信息。缺乏链特异性信息的文库，不利于新的RNA种类的检出以及RNA表达水平的量化^[1]。

IDT埃德特所独有的Adaptase专利技术，允许同时在单链DNA上进行加尾和接头连接反应。高效率、不依赖模板的Adaptase反应，可降低碱基偏好性并提升文库覆盖程度。该技术已经应用到多种IDT埃德特文库构建试剂盒中，包括xGen™ Broad-range RNA Library Prep（图1左）及xGen™ RNA Library Prep（图1右）。两款RNA建库试剂盒均能接受较为宽泛的样本起始量，并有着高质量、优秀的测序数据产出，深化、加速用户的RNA-seq研究。常规的RNA文库构建流程中需要将合成的第二链cDNA中加入互补配对的“U”碱基，后续含有“U”碱基模版被消化或无法扩增，以便最终得到链特异性文库。IDT埃德特独家提供的RNA建库试剂盒则借助Adpatase技术，利用第一链cDNA模版，可以构建链特异性RNA文库，无需常规的第二链cDNA合成。

图1. 左：xGen™ Broad-range RNA Library Prep试剂盒；右：xGen™ RNA Library Prep试剂盒。

IDT埃德特xGen™ Broad-range RNA Library Prep由于使用专利的Adaptase®技术，无需第二链cDNA合成及接头浓度稀释。即便对于低起始量及降解样本，仍可保证高连接及转化效率，有着更低的接头二聚体比例。在同等RNA起始量的情况下，与另一品牌试剂盒相比（下图右图），xGen™ Broad-range RNA Library Prep文库质量更高。

使用IDT埃德特xGen™ Broad-range RNA Library Prep构制备的RNA文库，在各项测序指标都具有优势：更高的Mapping率、更多的基因和转录本检出、更低的Dup率。即使在样本起始量较低的情况下（10ng总RNA用于PolyA富集），仍可得到高质量测序数据，可让用户即便面对最具挑战性的样本，仍可得到理想的实验结果。

即使在样本起始量较低的情况下（10ng总RNA用于PolyA富集，100pgmRNA），IDT埃德特xGen™ Broad-range RNA Library Prep也可保证转录本覆盖度的均一性，从而提升了有效的转录组注释。

基因融合与癌症密切相关，因此深入研究基因融合的发生对于探究癌症发生发展的机理具有重要意义。此外，虽然基因融合的发生率相对于其他种类的突变类型较低，但相关靶向药物的疗效却很显著。FDA或NMPA针对ALK、ROS1、RET、FGFR2和NTRK1/2/3等融合靶点已经批准了多款相应的靶向药物。随着伴随诊断的重要性不断提升，NGS方法学逐步成为分子检测的重要手段。针对不同适应症，国内外专家在NCCN指南、CSCO指南及专家共识中不约而同地提及RNA-seq检测基因融合的必要性，如：NCCN指南在中枢神经系统癌症中推荐使用RNA-Seq为检测RELA与BRAF基因融合的手段；CSCO指南在对于肺癌脑转移的病理诊断中，推荐分子检测层面推荐进行ALK融合及ROS融合等基因检测，RNA-Seq为检测手段之一^[2,3]。

融合基因的NGS检测，既可以采用DNA-Seq，也可以采用RNA-seq。如下图列出几种情况，在设计融合基因突变检出实验时，更建议使用RNA-seq或杂交捕获进行检测: (1) 一些临床相关的重排事件发生在区域较大的内含子中，需要更多捕获探针进行覆盖及测序数据量。像MSK-IMPACT等基于DNA样本类型的捕获设计，并没有纳入NTRK3和NRG1基因中某些重要内含子，仅仅是因为它们区域太大（每个 >90 Kb）；(2) 融合事件发生在内含子区域，面对另外一个难题在于通常包含高度重复序列或者复杂的基因组事件，这也增加杂交捕获设计的难度。对于ROS1的内含子31尤其如此，因为它包含两个长散在重复序列（LINE），许多基于DNA的分析，包括MSK-IMPACT，都未能很好地覆盖该内含子；(3) DNA水平的突变检出（特别是低频突变），更容易受肿瘤组织样本身纯度影响^[4]。

IDT埃德特xGen™ Broad-range RNA Library Prep搭配IDT埃德特杂交捕获探针（xGen™ Exome Hyb Panel），可以为低至100pg FFPE RNA样本提供从RNA建库到文库富集全流程解决方案。使用10、100ng不同降解程度FFPE样本（DV200: 54-73%），对比无降解的RNA标准品（含有10种人类细胞系），低质量FFPE样本仍有着高质量的测序指标（高mapping率及外显子率等）。