前列腺癌（PCa）是男性最常见的恶性肿瘤之一，临床上前期主要采用雄激素剥夺疗法（ADT）治疗前列腺癌，但几乎所有患者最终都会发展为致命性的转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）。目前，前列腺特异抗原（PSA）仍是PCa的主要筛查手段。但PSA并不是最佳的肿瘤生物标志物，会导致过度诊断与诊断不足，以及过度治疗和治疗不足。因此，临床迫切需要更好的肿瘤生物标志物，用于前列腺癌诊断、判断疾病分期和监测治疗反应。

除基因突变外，癌症的发生过程还涉及表观遗传学特征的改变。癌症中DNA甲基化的改变已经被认为是开发强大的诊断、预后和预测疾病发生的最有潜力生物标志物。目前，基于液体活检循环游离DNA（ctDNA）的检测方法主要通过游离DNA测序以检测体细胞的突变。但是，考虑到复发突变的数量有限，这些方法在早期癌症患者中的敏感性较低。相比之下，组织和癌症类型特异性的高水平表观遗传改变没有类似限制，因此在早期肿瘤患者的肿瘤检测和分类鉴定中具有更大的开发潜力。

近日，来自维也纳医科大学的Gerda Egger教授团队，将液体活检、表观遗传性改变和机器学习结合到一起，分析了几种基于DNA甲基化的生物标记物在前列腺癌症患者的液体活检中具有检测转移性疾病、监测治疗反应和预测疾病进展的潜力。该研究为基于血浆游离DNA甲基化模式的癌症早期微创检测、分型和预后的生物标记物研发奠定了基础。研究成果已发表于Molecular Cancer期刊上，文章题目为“Identification of tumor tissue-derived DNA methylation biomarkers for the detection and therapy response evaluation of metastatic castration resistant prostate cancer in liquid biopsies”。

已有研究报道正常组织和PCa组织之间的DNA甲基化谱存在差异。为了揭示PCa检测中存在的潜在DNA甲基化生物标记物，研究人员结合实验和电子数据确定了92个甲基化标记物，在肿瘤和正常邻近组织之间具有显著差异的甲基化，随后又在PCa患者的ctDNA上进行了测试（图1）。

图1.实验的工作流程，来源：Molecular Cancer

为了分析92个甲基化标记物是否适合检测患者血浆样本中ctDNA的PCa特异性DNA甲基化，研究人员对174份血浆样本进行分析，包括48例良性患者、65例局限性PCa患者和61例mCRPC患者，使用高通量甲基化敏感的限制性内切酶（MSRE）消化从血浆中分离的ctDNA，然后通过实时PCR技术进行甲基化检测（MSRE-qPCR），甲基化水平用甲基化百分比参数（PMR）表示。对PMR进行无监督聚类分析，结果显示大多数mCRPC血浆样本的甲基化水平较高，正常和局限性PCa血浆样本的甲基化值非常低（图2）。

图2. MSRE-qPCR分析得出的PMR值的无监督聚类。来源：Molecular Cancer

研究人员基于几种不同算法（对角线性判别分析（DLDA）、K-近邻、支持向量机和（贝叶斯）复合协变量预测（BCCP/CCP））构建了分类预测模型，通过输入PMR值，将92个候选甲基化标记用于预测模型计算。将预测模型应用于良性与mCRPC样本组时，83个甲基化标记物可准确将93%-96%的样本进行正确分类。研究人员还通过递归特征消除法识别出可检测mCRPC的最小标记基因集（CHST11、CUGBP2和PCDHGC4），能够准确地将mCRPC与局限性PCa和良性患者联合组区分开（图3）。根据使用的预测模型，最小标记基因集可将92%-95%的样本进行正确分类，AUC为0.963（CCP）、0.978（DLDA）和0.953（BCCP）（图4）。以上数据表明，mCRPC可以基于甲基化特征进行识别，具有较高的准确性。

图3. mCRPC、局限性PCa和良性患者中的三个标记基因（CHST11、CUGBP2和PCDHGC4）的甲基化水平。来源：Molecular Cancer

治疗反应监测是mCRPC临床管理的一项重要任务。随着mCRPC患者可供选择的治疗方法不断增多，选择合适的治疗方法并在反应失败时及时调整治疗策略非常重要。为了评估研究确定的甲基化标记物在监测mCRPC患者治疗反应中的潜力，研究人员对17例对治疗有应答的和12例无应答的mCRPC患者进行了MSRE-qPCR分析。研究发现，治疗后与治疗前样本相比，无应答患者检测到甲基化水平升高，应答患者甲基化水平降低。研究人员基于3个不同标记基因（AKR1B1、LDAH、KLF8）的ctDNA甲基化水平，构建了一种甲基化分类模型，用于监测不同治疗方案的治疗反应，可正确分类83%–90%的应答与无应答患者，AUC为0.902（CCP）、0.892（DLDA）和0.863（BCCP）（图5）。因此，该研究确定的甲基化标记物可用于早期检测无应答者，并指示患者预后，从而使患者分层调整治疗并准备适当的对策。

为了检测甲基化标记物是否可以预测临床结果，例如放射学无进展生存期（rPFS），研究人员对治疗后患者血浆中候选基因的甲基化水平进行了生存统计。分析显示，包括三个标记基因（AKR1B1、KLF8、LDAH）在内的几个候选标记物的甲基化水平和rPFS下降具有显著相关性（图6）。

基于血液的游离DNA突变检测的敏感性和准确性及其检测早期癌症的能力目前仍在不断改进开发。一种潜在的替代方法是检测游离DNA上的甲基化水平，因为在肿瘤中，DNA甲基化水平会发生显著的变化。该研究中，研究人员通过对大量血浆样本进行对比分析，证明可以通过检测游离DNA的甲基化水平进行肿瘤检测和分类鉴定。基于DNA甲基化的生物标志物，可实现对mCRPC进行高特异性和敏感性的分类，并能够在不同治疗模式下区分有应答者和无应答者。重要的是，几个单独的标记基因具有独立于其他临床变量的放射学无进展生存的预后潜力。

参考文献：

1. Shen Shu Yi et al. Sensitive tumour detection and classification using plasma cell-free DNA methylomes[J]. Nature, 2018, 563（7732）: 579-583.

2. PalancaBallester Cora et al. Cancer Epigenetic Biomarkers in Liquid Biopsy for High Incidence Malignancies[J]. Cancers, 2021, 13（12）: 3016-3016.