先天性心脏病（Congenital heart disease, CHD）是新生儿最常见的先天性缺陷类型之一。在世界范围内, CHD的发病率及病死率均较高，给社会及家庭带来沉重的负担。由于遗传因素千差万别，异质性较大，因此难以确定驱动CHD发生的基因突变。

GATA4和TBX5是两个重要的心脏相关转录因子（Cardiac Transcription Factors, cTFs），也是在家族性CHD中最早确定的单基因，在整个基因组中协同作用于DNA以调节心脏发育。鉴定人类心脏发育过程中的GATA4和TBX5（GT）蛋白相互作用体可以帮助解析CHD疾病的发生机制，有助于预测蛋白质编码变异对CHD的影响。

近日，美国Gladstone Institutes等单位的联合研究团队在Cell发表了题为“Transcription factor protein interactomes reveal genetic determinants in heart disease”的文章。研究团队通过整合蛋白质组学和人类遗传学方法，解析人类心脏祖细胞内源性GATA4和TBX5的蛋白质相互作用体，以识别和优先检测潜在的心脏疾病基因、CHD相关变异体，揭示了心脏基因调控的各方面功能。

为了鉴定人类多能干细胞源性心脏祖细胞（CPs）中GATA4和TBX5的蛋白相互作用体（GT-PPI），研究团队首先对每个内源性cTF的抗体进行亲和纯化和质谱（AP-MS）。随后，利用CRISPR-Cas9生成了克隆性TBX5或GATA4纯合敲除（KO）hiPSC系作为阴性对照。与此前的研究一致，GATA4和TBX5敲除细胞虽然可以分化为CMs，但其分化效率较低。

研究团队对经核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶处理的野生型（WT）和GATA4/TBX5 KO细胞进行质谱分析，然后处理获得WT CPs中GT相互作用的初始列表。在此基础上对KO的质谱数据进行关联分析，最终得到272个蛋白质，包含此前报道的与GATA4和TBX5产生相互作用体的几个蛋白质以及其他新型互作体。

图1. hiPSC衍生的心脏祖细胞进行GATA4和TBX5 AP-MS的策略示意图。来源：Cell

与心脏发育过程中GATA4和TBX5的相互依赖性一致，构建的蛋白质互作网络也显示出一些重叠，但检测到的大部分相互作用体对每个cTF都是独特的。此外，这两个蛋白质互作网络都富集在涉及类似生物过程的蛋白质中，其中最具代表性的两个过程是转录调控和染色质修饰，这与cTF在基因调控中已经确定的功能相符。

图2. 构建产生心脏祖细胞中GATA4和TBX5的蛋白相互作用体。来源：Cell

为了确定在人类CPs中发现的GT相互作用是否有助于预测CHD的遗传危险因素，研究团队评估了其与新生变异体（DNV）的交集。结果表明，与对照组相比，CHD队列中GT相互作用体中更容易出现改变蛋白质的DNV。在对照组和CHD组中，GT-PPI蛋白中出现非常罕见的功能缺失（Loss-of-function, LoF）遗传变异的频率相同。

图3. GATA4和TBX5蛋白相互作用体中全新变异体在CHD中富集。来源：Cell

研究团队还分析了GT-PPI中鉴定的CHD相关基因是否具有增加其致病可能性的特征。结果显示，PPI中的大多数CHD相关基因对LoF变异都极其不耐受，并且单倍功能不全评分显著升高。此外，对LoF变异极度不耐受和单倍功能不全也是与发育障碍相关的基因的共同特征。

图4. GATA4和TBX5相互作用体中的新生变异表现出疾病的典型特征。来源：Cell

GLYR1可通过核小体去甲基化参与染色质修饰和基因表达调控。GLYR1的错义CHD DNV涉及一个高度保守的脯氨酸被一个亮氨酸取代，这一位点被描述为介导GLYR1单体间相互作用的过程。分析发现，GLYR1在局部水平上的结构动力学显示，与WT蛋白相比，GLYR1P^P496L的整体灵活性较低。 

图5. CHD相关变体GLYR1的功能影响。来源：Cell

为了更好地表征P496L错义突变对GLYR1蛋白功能和基因调控的影响，研究团队通过CRISPR-Cas9同源性定向修复，构建了一个P496L错义突变（GLYR1^P496L）hiPSC纯合细胞系，并对GLYR1^WT和GLYR1^P496L进行CM分化后，通过单细胞转录组测序技术研究了它们的转录特征。

在分化的第6天，研究团队发现GLYR1^WT和GLYR1^P496L细胞能够聚集在一起，并表达与CPs相关的标记基因（cluster 0）。CPs细胞亚群的基因表达差异分析结构表明，在GLYR1^P496L中存在下调的1,458个基因主要参与心脏发育、细胞周期、ATP代谢等过程，提示P496L错义突变对心脏发育的不良影响。

图6. 单细胞转录组测序数据揭示GLYR1变体对心肌的影响。来源：Cell

为进一步评估GLYR1^P496L突变体在体内的生物学功能，研究团队使用CRISPR-Cas9构建了一个含有P495L单核苷酸（与人类P496L同源）变异的小鼠品系（Glyr1^P496L/+），并将Glyr1^P496L/+小鼠与GATA4突变小鼠杂交。与预期结果相同，GATA4突变小鼠表现出部分外渗性心脏缺陷，心室缺陷发生率为22%；Glyr1^P496L/+小鼠表现出低外显率心脏改变，其中最常见的是卵圆孔未闭导致的持续性心房间传导。

此外，组织学及超声心动图分析也显示，化合物Glyr1^P496L/+:Gata4^+/-心脏均为畸形型，其中房室间隔缺损约占80%。以上数据表明，小鼠中存在GATA4-GLYR1基因相互作用。

图7. 小鼠体内数据揭示GLYR1变体对心肌的影响。来源：Cell

图8. 研究概要图。来源：Cell