人体里大概有37万亿个细胞，所有细胞都是由同一颗受精卵发育而来。世界上没有两个一模一样的人，同样，也没有两个一模一样的细胞。从一颗小小的受精卵开始，随着人体生长发育，细胞之间的差异越来越大，承担不同的功能。细胞的异质性和复杂性给人类发育、干细胞生物学等诸多领域的研究提出了巨大挑战。
自2009年开发出第一种单细胞转录组测序技术，多个研究领域发生了重大的变化。单细胞测序技术可以研究单个细胞内的基因表达情况，同时解决用组织样本测序无法解决的细胞异质性难题，让解析单个细胞的行为、机制及其与机体的关系成为了现实。近日，北京大学生命科学学院、生物医学前沿创新中心（BIOPIC）汤富酬教授与文路副研究员受邀在Precision Clinical Medicine杂志上发表题了为“Recent advances in single-cell sequencing technologies”综述性文章。从单细胞表观基因组测序、单细胞基因组测序技术用于谱系追踪、单细胞空间转录组技术、基于第三代测序平台的单细胞基因组测序，四个方面系统总结了单细胞测序技术的最新进展，并探讨了单细胞测序技术的潜在应用和未来发展方向。
文章已发表于Precision Clinical Medicine杂志上
文章从单细胞染色质状态、三维基因组、组蛋白修饰和转录因子结合、DNA甲基化和染色质状态/转录组双组学五个方面进行了综述。
表观遗传调控是基因调控网络的核心，对了解转录是如何被调控的，以及表观遗传记忆是如何在干细胞及其分化后代中建立和维持的提供了重要见解。细胞的表观基因组是细胞中存储和维持的所有表观遗传信息，由多种精确调控且紧密相互关联的表观遗传学特征组成，包括染色质状态、3D基因组、DNA甲基化、组蛋白修饰以及转录因子结合。目前，针对其中许多特征的单细胞表观基因组测序技术，包括基于Tn5转座子的染色质可及性测序ATAC-seq技术，基于enzyme-tethering策略的CUT&Tag等技术，已常规用于干细胞生物学研究。
文章从单细胞基因组测序技术和基因组突变信息两方面进行了综述。
干细胞是人体内一类具有自我更新以及多向分化潜能的原始细胞群体。在特定的条件下，干细胞能够分化成为人体各个组织所需的多种类型的细胞。对于理解干细胞生物学至关重要的一层信息，是干细胞自我更新和分化过程中细胞的轨迹或谱系“历史”，这些信息对于严格确认干细胞在体内的多向分化潜能至关重要。此外，细胞的分裂、分化并非百分百精确，细胞分裂会随机产生少量突变，突变的不断积累可作为识别和追踪细胞谱系关系的独特标志。但由于伦理限制，基因编辑通常被禁止用于人类，因此人体细胞基因组中的内源性遗传变异，包括单核苷酸变异（SNV）、拷贝数变异（CNV）、插入和缺失（Indel）、结构变异（SV）、微卫星不稳定性以及线粒体突变等，为追踪体内完整人体组织中细胞的发育轨迹提供了宝贵的信息。近年来，快速发展的单细胞基因组测序技术，逐渐开始用于绘制人类胚胎和器官发育谱系图谱。
空间位置信息对于细胞命运至关重要，新的空间转录组方法不仅能够带来转录组信息，同时还提供空间信息，帮研究者更好辨别转录的位置。将研究拓展到单细胞分辨率可更大程度提升科学家对单个细胞的认识和解读。近年来，空间转录组技术得到了迅速发展和改进，特别适用于无法进行基因标记的人类研究。空间转录组学包括三类技术，第一类是单分子荧光原位杂交技术（smFISH），第二类是原位测序技术，第三类是基于原位捕获策略的空间转录组技术。（图1）前两类技术具有单细胞分辨率，第三类技术正逐步接近单细胞分辨率。
smFISH的代表技术是seqFISH和MERFISH。seqFISH可以通过多轮杂交在RNA上赋予时间条形码，允许许多分子被多重化。MERFISH是一个高度多重化的smFISH成像方法，可以在单个细胞中鉴定数千种RNA的拷贝数和空间定位, 该技术使用组合标签、连续成像等技术来提高检测通量。原位测序技术可以对固定组织或细胞样本中的mRNA进行直接测序，其强大之处在于发现测序信息与其位置之间的关联，其代表性技术分别为FISSEQ、ISS、STARmap、ExSeq。
图1.空间转录组学技术。
三代测序技术（Third-generation sequencing ，TGS）是指单分子测序技术，在测序过程中不需要涉及PCR扩增，实现对每一条DNA分子的单独测序。三代测序技术具有超长读长，不需要模板扩增、运行时间较短、直接检测表观修饰位点等特点。目前比较有代表性的三代测序技术分别是Pacific Biosciences（PacBio）公司的单分子实时测序技术和Oxford Nanopore公司的单分子纳米孔测序技术。
与二代短读长测序技术相比，三代单分子长读长测序技术用于单细胞组学有几方面优点。（图2）首先，三代测序技术可以获得超长reads，弥补二代测序技术中的reads过短的不足。基于TGS的scRNA-seq技术可以通过直接读取反转录全长cDNA，有效获取高质量的单个RNA分子全部序列，进而深入研究可变剪接转录本。其次，基于TGS的scRNA-seq技术显著提高了SV检测的可靠性和分辨率，能够有效地检测结构变异，尤其是复杂结构变异。虽然二代短读长测序能够有效地检测包括SNV和Indels在内的基因组变异，但是对于包括长片段插入或缺失、基因组重复、异位和环状DNA等基因组结构变异的检测却有很大局限性。第三，单分子纳米孔测序能够直接检测5mC、6mA等表观遗传修饰。
图2.基于第三代测序平台的单细胞测序技术。红色与绿色表示已经实现的检测，其中红色表示基于第三代测序平台比基于第二代测序平台的方法所具有的优势方面。
单细胞组学测序技术已经干细胞生物学领域取得了丰硕的进展。但目前的技术对于人类体内细胞研究仍然不理想。单细胞组学技术具有很高的通用性，适用于从植物到医学的广泛生物研究领域，同时其灵敏度和准确性仍需要改进。近年来，单细胞测序技术的通量、自动化和检测速度大大提高且成本不断降低，但仍未满足临床检测的要求。特别是对于干细胞研究，该技术的时间和空间分辨率不令人满意，仍有待改进。未来，通过单细胞多组学测序，有可能识别人体内干细胞的基因变化，及其与干细胞表型变化的潜在联系。如果单细胞多组学技术与基因编辑工具、3D类器官培养系统等其他强大技术进行适当整合，必将加速将在动物模型中挖掘的丰富而深入的干细胞知识转化为更具临床相关性的人类干细胞知识。
图3.单细胞多组学测序技术的当前状态。来源: Precision Clinical Medicine
参考文献：
https://academic.oup.com/pcm/article/5/1/pbac002/6517768
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