微小残留病灶（MRD）检测的突变位点通常在十几个到几十个，其Panel覆盖范围较小（＜50Kb）。利用捕获技术精准检测大量低频突变需要极高的深度和准确性，这严重限制了检测的广度（即不同位点的数量）。通常DNA测序的广度与深度之间的内在权衡意味着要么在高深度检测很少的突变，要么在低深度检测很多突变，不能两者兼得。
近日，一篇发表在国际杂志Nature Biomedical Engineering上题为“Massively parallel enrichment of low-frequency alleles enables duplex sequencing at low depth”的研究报告中，来自麻省理工学院、布罗德研究所、丹娜-法伯癌症研究所和哈佛医学院的联合研究团队报告了一种名为“MAESTRO（minor allele enriched sequencing through recognition oligonucleotides）”的方法。MAESTRO可利用突变特异的短链探针，有效地降低野生型reads的含量，大幅降低测序数据量，同时利用二次捕获提高目标区域reads比例。研究显示，MAESTRO能够以最小的测序规模、更低的成本准确有效地从血液样本中识别数千个DNA突变。
文章发表于Nature Biomedical Engineering
文章作者Viktor A Adalsteinson表示：“在临床样本中发现罕见突变在生物医学和诊断学等领域都有重要意义。目前的技术需要大量测序才能找到低频DNA突变，而MAESTRO的灵敏度足以在测序量降低99%的情况下找到数千个突变。在血液样本中准确检测肿瘤DNA对于科学家们而言是一大挑战，尤其是在寻找治疗后所残留的少量MRD。我们看到了MRD检测对更高灵敏度的需求。”
研究人员从两个人类细胞系中创建了1:1000稀释的剪切基因组DNA，确定了唯一的单核苷酸多态性（SNP）作为克隆突变的替代物，并生成了双重测序文库，这些文库被拆分用于杂交捕获。随后，研究人员设计了约10000个有严格长度和ΔG的MAESTRO探针，用于预定义突变的单核苷酸鉴别，只有含有跟踪突变的分子才能被捕获并测序，以达到错误抑制的双重目的。（图1a）MAESTRO方法利用等位基因特异性杂交和短探针，以及异源双链DNA和同源双链DNA的热力学差异（图1c），来丰富条形码库，并通过Minimal测序在每个DNA的双链上检测突变。（图1b）结果表明，MAESTRO可以通过更少的测序来发现DNA双链中的大多数突变。
图1. MAESTRO通过在临床样本中进行最少的测序，实现了准确的突变跟踪。
研究人员对16名乳腺癌患者的组织活检进行了全外显子组测序，确定患者突变的中位数为40个。同时，研究团队对比了MAESTRO和常规检测组的突变检测效果，发现MAESTRO和常规检测组之间的验证突变分数相似，MAESTRO的分数略低，可能是由于探针丢失（图2a）。与在<0.10 VAF下鉴定的突变相比，MAESTRO在>0.10 VAF（图2a）下鉴定的突变比例较高，被发现为“未验证”的突变往往来自肿瘤全外显子组测序的最低VAF部分。（图2b）以上结果表明，MAESTRO能够准确验证全外显子组和全基因组测序中发现的大量突变。
图2.全外显子组肿瘤样本的MAESTRO指纹验证。
此外，研究人员分析了是否可以通过追踪更多的SNP和有限的血容量来实现更高的灵敏度。1μl的指尖血含有约104个白细胞，研究人员首先比较了MAESTRO和传统检测方法在18×复制1:105稀释液和17×复制阴性对照样品中检测438个SNP的效果。数据显示，MAESTRO在使用更少测序量的情况下，在所有1:105稀释样本和阴性对照样本中分别发现了81%和80%的样本来源SNP，明显多于阴性对照（图3a），应用MAESTRO在16× 重复1:105稀释液、17× 1:106稀释液和12×阴性对照中检测104个样本来源SNP，发现在1:105稀释液样本中检测到的SNP数量大幅增加，显著高于阴性对照组。在1:106稀释液中也观察到更高的突变数量。（图3b）结果表明，追踪数千个全基因组、特异性SNP可以显著提高信噪比，这对于检测极低水平的嵌合体很重要。
图3. MAESTRO可以在1:105稀释度下检测到高于噪音的信号。
MAESTRO能否增强MRD检测效率？研究人员使用先前鉴定的来自癌症患者的cfDNA，将其掺入健康者样本的cfDNA，创建了针对1:100到1:305肿瘤样本稀释液。（图4a）在每次稀释时复制20ng文库，并利用MAESTRO和常规方法检测患者肿瘤全基因组测序中的978个全基因组单核苷酸变异（SNV）。数据显示，MAESTRO验证了978个突变中的94.7%。（图4a）MAESTRO在稀释至1:105肿瘤样本中发现了与传统方法相当数量的突变，所需测序量为原来的1/50。结果表明，MAESTRO的检测极限与传统的cfDNA相当，且MAESTRO能够以更低的成本追踪cfDNA的数千个全基因组突变。
此外，与传统检测方法相比，使用MAESTRO能够在肿瘤患者中检测到更多的cfDNA突变，且在任何不匹配的样本中均未检测到假突变，表明MAESTRO可以通过在cfDNA中准确检测全基因组肿瘤突变来提升MRD检测效率。（图4c-d）
图4. MAESTRO改善了术前MRD的检测。
作为一种利用突变特异短链探针结合二次捕获的测序方法，MAESTRO通过高精度测序，同时富集和检测数千个突变，并在一系列样本类型中具有高度适应性，可以追踪多达10000个不同的低频突变（<0.1%VAF）。总之，MAESTRO提供了一种强大的方法，提高了低频突变检测的广度、深度、准确性和效率。MAESTRO打破了DNA测序的广度与深度的桎梏。利用更少的测序量实现高精度检测，意味着在跟踪临床样本中的许多低频突变时，不再需要以广度换取深度，或以准确性换取效率。
Gydush, G., Nguyen, E., Bae, J.H. et al. Massively parallel enrichment of low-frequency alleles enables duplex sequencing at low depth. Nat. Biomed. Eng 6, 257–266 (2022). DOI: 10.1038/s41551-022-00855-9
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