氧化性DNA损伤与炎症、癌症和衰老等多种病理状态密切相关。在生物学背景下，活性氧自由基（ROS）是氧正常代谢的天然副产物，并在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用。但是在环境压力（例如紫外线）期间，ROS水平会急剧增加，可能会对细胞结构造成严重损害，诱导DNA的碱基氧化及单链断裂(SSBs),。最常见的DNA碱基氧化损伤是致突变的氧化鸟嘌呤（8-oxo-G）。此外，嘧啶损伤是一种ROS产生效率较低的反应，而氧化剂高锰酸钾（KMnO4）例外，它很容易氧化胸腺嘧啶，形成胸腺嘧啶二醇。
目前用于绘制DNA氧化损伤图谱的方法，分辨率可达150至250个碱基对（bp）。但绘制氧化DNA碱基图谱需要实现单碱基特异性，目前尚没有直接的方法可在哺乳动物细胞中以单碱基分辨率在全基因组范围内满足这一需求。
近日，范安德尔研究所研究团队在Science Advances期刊发表了一篇题为“Concordance of hydrogen peroxide–induced 8-oxo-guanine patterns with two cancer mutation signatures of upper GI tract tumors“的文章。研究人员应用CD-seq（ circle-damage-sequencing ）方法，以单碱基分辨率绘制了两种类型的氧化性DNA损伤图谱，即过氧化氢产生的氧化鸟嘌呤和高锰酸钾产生的氧化胸腺嘧啶，确定了鸟嘌呤氧化的三核苷酸序列模式，该模式显示出与癌症相关的单碱基替换特征SBS18和SBS36的高度相似性。研究数据表明，两种癌症突变特征SBS18和SBS36是由活性氧引起，并揭示了此前未被认识的高锰酸盐氧化序列特异性5'TA/C。
文章发表于Science Advances
研究人员使用过氧化氢作为生理相关性的ROS，在5-25 mM的浓度范围内培养人真皮成纤维细胞分离出DNA。在确认8-oxo-dG形成后，研究人员选择5mM和10mM H2O2处理的样品，用CD-seq进行了修饰碱基检测（图1）。结果显示，未处理的样品在间隙中含有54%的A或T和46%的G或C碱基，H2O2处理的细胞样品在间隙中主要具有G或C，频率为67%至77.5%。
图1.氧化鸟嘌呤的CD-seq定位。来源：Science Advances
研究人员将H2O2处理的细胞映射到hg19人类基因组，发现氧化碱基在基因间区域和内含子中富集。研究人员分析了从转录起始位点（TSS）上游-3kb所有基因的氧化碱基信号，根据TSS到转录结束位点（TES）的基因长度对其进行分类。结果发现，H2O2处理的样品在不同浓度之间显示出相似曲线，特征是TSS附近有强峰，TES附近有一个下降（图2）。这种信号分布大致遵循人类基因组的GC含量，如图2F所示。
图2. 8-oxo-dG在人类基因中的分布。来源：Science Advances
随后，研究人员分析了H2O2处理的人类细胞中鸟嘌呤氧化的三核苷酸序列。研究人员分别处理间隙中的A或T，中间碱基显示为G、A或T，5'和3'侧翼碱基可以是四个碱基中的任何一个，因此有48种组合。对于未处理的对照，不同三核苷酸的分布相对平坦，在序列5'TGG、5'AGG和5'GGG处有一些增强（图3A）。对于H2O2处理的样品，中心具有鸟嘌呤的三核苷酸显着增强（图3B）。受损最严重的三核苷酸序列始终是5'TGG。在中心含有氧化鸟嘌呤的三核苷酸以G作为受损碱基的两个相邻嘌呤以及序列5'TGC最常见。在图3E中，序列图显示鸟嘌呤是第11位的首选碱基，在5'方向上最优选的碱基是T、A和G，8-oxo-G的3'方向上最优选的碱基是G、A和C，T的代表性极低。
图3. H2O2处理的人成纤维细胞中8-oxo-dG形成的序列。来源：Science Advances
研究人员分析了8-oxo-dG特征和各种COSMIC特征之间的关系。对于SBS4、SBS18、SBS36和SBS39，研究发现8-oxo-dG特征和COSMICSBS4特征之间的相似性最高（图4），表明氧化鸟嘌呤的三核苷酸模式与人类癌症中富含的两个G/C到T/A突变特征一致。
图4. 8-Oxo-dG与癌症突变特征。来源：Science Advances
高锰酸钾氧化胸腺嘧啶并产生胸腺嘧啶二醇作为主要的DNA氧化产物。由于缺乏可用的方法，胸腺嘧啶氧化的序列特异性和基因组偏好仍然未知。为了分析高锰酸盐氧化的胸腺嘧啶，研究人员用高锰酸钾处理了人类U2OS细胞并分离了DNA，发现在CD-seq程序中用Endo III和 NEIL1裂解获得的序列模式几乎相同，并且由几乎100%的胸腺嘧啶组成，与高锰酸盐氧化和DNA糖基化酶特异性的特性一致。
研究人员分析了高锰酸盐处理细胞中胸腺嘧啶氧化损伤的三核苷酸序列。中间碱基显示为T、C或G，5'和3'侧翼碱基可以是四个碱基中的任何一个，同样产生48种组合。结果发现，氧化胸腺嘧啶的优选序列是5'CTA和5'TTA，其次是5'GTA、5'CTC和5'ATA（图5）。序列分析显示，受损T的5'位置显示出对嘧啶的轻微偏好，A随后常跟的是C，G或T的出现则少得多。以上数据揭示了迄今为止未知的高锰酸盐诱导的胸腺嘧啶氧化的DNA序列特异性。
图5.高锰酸盐处理的人类细胞中氧化胸腺嘧啶的序列水平分布。来源：Science Advances
综上所述， 研究人员提出了一种基于CD-seq的方法，用于在人类基因组中单碱基分辨率绘制各种类型的氧化损伤DNA碱基，为H2O2诱导的氧化鸟嘌呤和高锰酸盐诱导的氧化胸腺嘧啶定义了序列特异性模式。随着进一步的改进和有效的预防措施以防止DNA体外损伤，CD-seq方法有望以足够高的灵敏度检测人体组织中的氧化DNA碱基。
Jin SG, Meng Y, Johnson J, Szabó PE, Pfeifer GP. Concordance of hydrogen peroxide-induced 8-oxo-guanine patterns with two cancer mutation signatures of upper GI tract tumors. Sci Adv. 2022;8（22）:eabn3815. doi:10.1126/sciadv.abn3815
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abn3815
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