临床上，肿瘤异质性程度与治疗反应、转移能力和患者存活率显著相关，因此，深入认知细胞异质性和克隆适应度对癌症研究特别重要。虽然肿瘤细胞亚群突变谱的差异可能是肿瘤异质性的最佳参数，但最终影响疾病进展的是功能异质性，这可由遗传和非遗传异质性的因素决定。目前，大规模的测序相关研究，例如单细胞转录组测序，揭示了人类癌症的多种突变和转录图谱。然而，关于功能异质性对疾病进展的影响，仍需进一步分析研究。
在实验和临床前研究中，对肿瘤异质性和细胞可塑性的认知和适当建模对改善癌症治疗结果至关重要。其中，克隆动力学由克隆频率、空间邻近性、异型相互作用和细胞可塑性驱动，可以深刻地影响疾病的进展，而分子条形码技术的出现，使得同时追踪数以千计的克隆群体成为可能。
近日，来自哈佛大学医学院附属布莱根妇女医院的研究团队在Nature Communications发表了题为“Clonal barcoding with qPCR detection enables live cell functional analyses for cancer research”的研究性文章，报道了一种新型分子条形码技术SunCatcher。SunCatcher提供了一种快速、低成本和高灵敏度的方法来检测、鉴定、量化、分离和研究感兴趣的个体克隆或克隆混合物。条形码克隆可以单独研究或结合生成自定义池的克隆，因此，SunCatcher能够在实验期间对异质性和克隆适应性的分子、表型和功能基础进行纵向和回顾性分析。结果表明，SunCatcher对于检测和识别早期自发性骨骼和内脏肿瘤转移非常有效。总之，SunCatcher基本上可以应用于任何基于细胞的研究，并将成为一个有用的，广泛可获得的研究和发现工具。
文章发表在Nature Communications
研究团队对细胞进行分选，从异质亲本细胞群体中分离出单细胞置于96孔板。然后将每个单细胞衍生的菌落进行扩增，以生成非条形码克隆（NBC）。随后利用独特的分子条形码感染每个NBC群体，跟踪和量化每个克隆群体，这些细胞被称为条形码多克隆群体（BPP）。为保证条形码插入位点的克隆性，研究人员对每个BPP进行了一轮单细胞克隆扩增。接下来，为每个条形码随机选择一个种群来表示条形码克隆（BC）。在这个阶段，每个BC都有一个单一的、独特的24bp条形码，并为慢病毒插入位点克隆。因此，在接下来的实验中，可以单独分析BC，也可以以各种组合来创建自定义条形码池（BC池），用于任何实验或相关研究。总之，SunCatcher可以对感兴趣的活细胞进行纵向和回顾性分析。
图1. SunCatcher整体流程示意图，来源：Nat. Commun.
为了评估群体复杂性，研究人员监测了亚克隆过程中的细胞形态，发现每个细胞系的BC都表现出一系列的细胞形态，从均匀的上皮细胞到均匀的间充质细胞表型，并确认了BC池也和各自的亲本系相似，是形态多样化的。
研究人员使用基于qPCR的检测方法评估了培养基中BC池的组成和生长，时间为7天。结果表明，BC池的增殖率与亲本细胞系几乎相同，表明SunCatcher克隆条形码方法保留了原始肿瘤细胞系的异质性以及体内外生长动力学。
图2. SunCatcher条形码编码过程中的致瘤性检测，来源：Nat. Commun.
已有研究数据表明：增殖率决定克隆动力学，而最具增殖能力的克隆将支配肿瘤进展。然而，在疾病发展过程中，究竟是什么提供了最大的选择压力仍未被详细地阐明。例如，目前还不清楚肿瘤中最具优势的克隆是天生具有更强的增殖能力，还是它们的出现是通过选择性过程发生的。
作为回答这个问题的第一步，研究人员分析了每个Met1-BC单克隆群体的体外增殖率。在9天的时间中，每72小时计数一次细胞，计算每天的种群倍增值。结果发现增殖速度最快的克隆BC25比增殖速度最慢的克隆BC20的增殖速度快了2.3倍。更加重要的是，这些结果提示了具有内在致瘤潜能的克隆在经过长潜伏期后疾病进展的贡献可能被忽略，因为BC池肿瘤的伦理大小限制了这些克隆从潜伏期出现之前的终点。综上所述，这些结果表明，克隆动力学或环境驱动的选择压力最终影响某些BC的命运，而其他BC的固有增殖在多克隆环境中不受阻。虽然这些概念之前已经有初步发现，但SunCatcher可以在体内外识别和分析异质肿瘤中受这种动态过程影响的特定克隆。
图3. SunCatcher可在体内外检测克隆动力学，来源：Nat. Commun.
部分关于乳腺癌患者异种移植的研究表明，肿瘤转移可来自原发肿瘤中出现的低频率亚克隆。但由于各种原因，使用传统的实验检测方法，例如荧光素标记的肿瘤细胞，往往难以检测原位早期自发转移。因此，研究人员进一步测试了SunCatcher检测和识别包含自发转移的克隆的敏感性，为未来对这些转移克隆的功能分析提供基础。
为了评估自发性转移，研究人员将Met1-BC注射进入小鼠对侧乳腺，21天后检查内脏组织和骨骼组织。通过肉眼检查，研究人员并没有观察到任何明显的转移。但基于条形码qPCR的检测结果却显示，肺、长骨和下颌骨均包含了条形码信号。此外，在检测到条形码信号的组织中，不管原发肿瘤负担如何，股骨和胫骨自发转移的相对数量最多，另有80%小鼠有肺转移，40%的小鼠有下颌骨转移。
上述结果表明，SunCatcher为研究转移过程中的克隆动力学提供了一种功能性条形码方法。更加重要的是，基于qPCR的检测方法使研究人员能够识别和量化原位癌的早期转移。
图4. SunCatcher可对早期自发转移进行鉴定与量化，来源：Nat. Commun.
综上所述，该团队报道了新开发的SunCatcher克隆条形码方法，可用于对包含复杂、异质性细胞群体的亚克隆进行功能分析。SunCatcher中的每个克隆只针对唯一的条形码，因此避免了那些依赖于大型条形码库感染异质细胞群体的方法所带来的潜在并发症。此外，基于qPCR的BC检测更是一个快速、灵敏、可靠和廉价的方法。SunCatcher一个更重要的优势是能够识别和分析在实验过程中被消极选择的克隆，这种能力对于评估药物反应和识别关键的细胞脆性尤其重要。
1. Guo, Q., Spasic, M., Maynard, A.G. et al. Clonal barcoding with qPCR detection enables live cell functional analyses for cancer research. Nat Commun 13, 3837 (2022).
2. Shaffer, S. M. et al. Memory sequencing reveals heritable single-cell gene expression programs associated with distinct cellular behaviors. Cell 182, 947–959 e917 (2020).
3. Gutierrez, C. et al. Multifunctional barcoding with ClonMapper enables highresolution study of clonal dynamics during tumor evolution and treatment. Nat. Cancer 2, 758–772 (2021).
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