罕见的肿瘤特异性突变是监测恶性疾病进展和临床常规治疗反应的良好生物标志物，但需要高敏感、特异和低成本的检测技术才能广泛采用。目前，有多种方法被用于检测DNA样本中的低频率突变。例如，基本PCR程序的突变检测可用于单核苷酸变异，也可以在相当多的正常序列中检测到少量的基因突变，但这些方法无法提供定量结果。可进行肿瘤患者特异性微量体细胞突变的样本包括体液、血液或骨髓细胞（BM）中的无细胞DNA。
近日，来自瑞典乌普萨拉大学研究团队开发了一种高敏感度和选择性的分子扩增技术——superRCA分析，用于快速和高度特异地检测DNA样本中的低频基因突变，该技术可作为急性髓系白血病（AML）复发早期检测，以及时改变治疗方案的潜力。该研究结果发表Nature Communications上，文章题为“Ultra-sensitive monitoring of leukemia patients using superRCA mutation detection assays”。
文章发表在Nature Communications上
研究团队认为，未来将有越来越多的肿瘤患者进行恶性肿瘤测序和基因突变检测，从而为通过分析血浆、脑脊液或BM中的有核细胞来监测疾病，并提供良好的肿瘤特异性标记物。研究团队证明高度精确和有效的基因突变检测方法superRCA可以指导AML患者的治疗，可在肿瘤突变负荷（TMB）增加之前发现潜在的复发迹象。在AML和骨髓增生异常综合征（MDS）中，外周血可用于监测患者病情进展，极大地简化监测流程，缩短采样间隔以指导患者管理。
研究团队将superRCA方法与目前临床应用的NGS和ddPRC方法进行了比较（图1）。NGS可以用于检测比频率非常低的突变，但成本更高，而且周转时间更长。与superRCA反应产生的大量产物相比，ddPRC的灵敏度仍有不足之处。针对同一DNA样本中的12个突变，包括点突变和缺失，并将superRCA与NGS和ddPRC进行基准比对。结果显示，superRCA技术适用于检测已知存在于患者恶性细胞中的大量突变。除了研究中使用的初始PCR步骤外，利用间隙填充挂锁探针（也称为分子反转探针）可以以圆形形式并行捕获大组靶标序列。挂锁探针可用于靶标序列捕获，也用于基因分型。
图 1：通过流式细胞仪分析 superRCA 产物。
superRCA产生的高重复序列motif使它们适合于用荧光团标记的检测探针进行组合标记。superRCA分析是建立在低聚核苷酸链接反应的基础上，特别是挂锁探针来区分许多目标序列变异，包括单核苷酸变异、插入和缺失以及重复序列的可变长度。研究显示，superRCA的检出限低、精密度高，可对重复靶标序列进行高选择性基因分型（图2）。
superRCA的特性具有重要的临床优势。正如AML患者UPN125的分析结果所示，NGS分析在其初始治疗后未能检测到剩余的IDH2 p.R172K突变，因此暂停治疗，但superRCA和ddPRC分析都清楚地显示了该患者体内剩余的恶性克隆，并最终导致复发。在AML患者UPN126中，ddPRC分析报告为IDH2 p.R140Q阴性，但该突变仍可通过superRCA检测到。
图 2：AML患者BM样本中superRCA、NGS和ddPRC检测的基准测试。
superRCA方法具有灵敏度高、操作简单等优点。耗时3小时的检测方案只需要对DNA样本进行5次添加。每个初始DNA环在一个扩增过程中产生一个独特的、易于检测的微米尺寸的产物。通常，在每次反应中产生超过500万个这样的产物，除了流式细胞仪外，不需要其他专门设备就可以在几分钟内对每个样本的产物进行计数，从而获得极佳的定量精度。同时，superRCA具有广泛的靶标兼容性。superRCA分析可能会在未来的应用中呈现出优势，允许同时分析患者样本中的多个突变序列，可以根据需要通过流动检测进行联合或单独标记，从而提高检测灵敏度。
综上所述，该研究团队在此描述了一种高敏感度和选择性的分子扩增技术——superRRCA分析，用于快速和高度特异地检测肿瘤样本中的低频基因突变。通过使用标准的流式细胞仪，该方法可以精确、超灵敏地检测肿瘤细胞的单核苷酸突变序列，并检监测AML患者的治疗反应。该研究还证明了位于高GC区域的序列变异体可能被敏感地检测到。
Chen, L., Eriksson, A., Weström, S. et al. Ultra-sensitive monitoring of leukemia patients using superRCA mutation detection assays. Nat Commun 13, 4033 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31397-y
https://www.nature.com/articles/s41467-022-31397-y
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