癌症的早期发现可提高接受手术等有效治疗的可能性，增加患者的生存机会，降低死亡率。当前，液体活检越来越多地用于非侵入性癌症检测、预后和治疗监测研究。例如，使用循环肿瘤DNA（ctDNA）进行早期检测的方法可反映肿瘤特征，这些特征可以与癌症的病因和类型联系起来，例如点突变、拷贝数改变等。
突变事件在个体体细胞的一生中都在进行。内源性过程（如衰老）和外源性暴露（如吸烟）都会导致体细胞基因组中的不同突变。由于细胞分裂时会释放出游离的DNA片段（cfDNA）进入循环系统，因此cfDNA可能反映体细胞组织的突变特征。
传统上，从癌症组织全基因组测序（WGS）中提取体细胞突变特征，然后对匹配的肿瘤和正常样本进行中等深度的突变检测。但在低覆盖率的WGS数据中，体细胞和胚系突变很可能仅通过等位基因片段无法区分，这就使得那些基于每个位点等位基因片段的突变检测方法无效。
近日，美国MSK癌症中心研究团队在Nature Communications发表了题为“Genome-wide mutational signatures in lowcoverage whole genome sequencing of cellfree DNA”的文章。研究团队开发了一种名为Pointy的方法，该方法可以从低覆盖度的血浆WGS数据中分析全基因组突变特征。同时，研究团队还基于Pointy分析了单碱基替换（SBS）特征提取和机器学习相结合的特征分析和样本分类。总的来说，Pointy方法能够识别癌症个体血浆中的突变特征，使早期癌症检测以及癌症风险和病因的评估成为可能。
文章发表在Nature Communications
首先，为了克服从低覆盖度基因组数据中检测突变困难的难题，研究人员开发了一种特殊的分析流程Pointy。为了检测其性能，研究团队分析了一组4期结直肠癌（CRC）患者来源的数据，这些患者大多存在错配修复缺陷（MMR-D）和微卫星不稳定性（MSI）。在获得血浆WGS数据后，经过严格的质控，并利用Pointy对其突变特征进行表征。总的来说，患者突变特征整体符合该类疾病的突变谱。其中，在CRC样本中，Pointy检测到的贡献最大突变特征是SBS1和SBS54。与健康个体相比，CRC患者血浆中多个SBS特征的贡献明显更大，包括SBS1和SBS21，后者也与先前在这些患者中检测到的微卫星不稳定性（MSI）一致。
考虑到衰老和MSI在该CRC队列中的作用，研究人员还分析了衰老和MSI特征，包括突变特征SBS1、SBS5、SBS20和SBS21。在CRC患者的血浆中，衰老和MSI信号的贡献显著更高，并且多重衰老和MSI相关特征与ctDNA分数和TMB呈显著正相关。
图1. 结直肠癌患者突变特征分析，来源：Nature Communications
研究团队利用SBS突变谱区分了癌症和健康样本。为了使信噪比最大化，研究人员去除了单核苷酸多态性（SNP）。SBS突变特征被用于机器学习分类。主成分分析（PCA）结果显示，癌症患者和健康对照的区分基于两个主要成分PC1和PC2（特别是PC2），并且PC1和PC2均与ctDNA分数显著相关。进一步评估PC1和PC2的SBS特征贡献，结果显示SBS8是PC2的最大贡献成分。
为了区分癌症或健康样本，研究人员使用SBS突变作为机器学习模型的输入，发现在模型中加入ctDNA片段信息可将随机森林模型的AUC提高至1.00。
图2. 结直肠癌的检测和分类，来源：Nature Communications
考虑到Pointy数据中衰老特征的富集，研究团队还探索了健康个体中其与实际年龄的关系。基于159个健康个体的血浆数据（年龄范围为49-75岁，中位年龄为54岁），发现突变特征SBS1和SBS5均与生物年龄呈显著正相关。
图3. 健康个体衰老特征的分析，来源：Nature Communications
为了将Pointy应用于所有癌症类型，研究人员使用去除SNP的SBS突变特征进行癌症检测和分类，ctDNA信息也纳入到每个模型。结果表明，对于所有癌症类型和分期的总体检测AUC为0.96；在所有分期中，非小细胞肺癌的AUC值为0.99，乳腺癌0.99，CRC为0.98，胃癌为0.92，卵巢癌为1.00，胰腺癌为0.88，表明Pointy对不同癌症类型、各分期患者检出率均较高。
图4. Pointy对不同癌症类型的检测，来源：Nature Communications
结 语
研究团队利用开发的新型分析流程Pointy在两个独立的数据集中发现了低覆盖率血浆WGS的突变特征，并且揭示了血浆中外源性和内源性突变过程，包括衰老和MSI标记等。此外，研究人员在健康个体的血浆中发现了与年龄相关的突变特征，这与此前在人类组织中的发现一致，并展示了使用这些标记进行癌症检测的敏感性和特异性。
图5. 研究概括图，来源：Nature Communications
虽然受到技术和生物噪音的影响，但这一低覆盖率血浆WGS的检测方法为cfDNA中的突变特征及其在肿瘤学中的潜在用途提供了一个深入的见解。未来更深入的测序将使人们能够更详细地探索相关标记物的特征，这些特征可能在癌症发展之前和过程中发挥作用。另外，利用集成机器学习方法，将突变特征与其他参数（如cfDNA片段模式）结合起来，检测灵敏度可能会进一步提高。
Wan, J.C.M., Stephens, D., Luo, L. et al. Genome-wide mutational signatures in low-coverage whole genome sequencing of cell-free DNA. Nat Commun 13, 4953 (2022).
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