基因疗法，是通过将患者的功能障碍基因替换为功能拷贝实现治疗目的。目前，大多数基因疗法是通过逆转录病毒载体传递的，并以随机或半随机的方式整合到基因组，这导致了不可预测的基因表达模式、内源性转录中断甚至是恶性肿瘤。提高工程细胞安全性的一种方法是将转基因转入被称为“基因组安全港（GSH）”的预定义基因组位点。
一个理想的GSH，首先应该易于转基因整合，并通过所需细胞/组织中的同源定向修复（HDR）实现高效率的转基因传递。其次，它应该在一个活跃的转录区域，而不是沉默机制的目标，允许细胞类型和组织特异性表达。最重要的是，出于安全考虑，GSH不应与基因组中任何已知的功能序列重叠，包括外显子、启动子、增强子、转录单位和超保守区域，或影响附近的基因表达。
近日，美国圣裘德儿童研究医院团队联合罗格斯大学遗传学系团队开发了一个计算框架，通过整合多态移动元件插入（pMEI）在健康个体中的分布与基因表达、3D染色质组织和表观遗传修饰信息，促进细胞类型特异性GSH识别和验证。将框架应用于1000 Genomes项目和基因型组织表达（GTEx）项目中确定的pMEI，研究团队确定了血细胞中的19个候选安全港和脑细胞中的5个候选安全港。其中，血细胞中的3个候选位点被证明了转基因的稳定表达，且不会破坏宿主红细胞中的附近基因。研究团队将研究结果发表Genome Biology上，文章题为“Genomics and epigenetics guided identification of tissue-specific genomic safe harbors”。
随着基因组学和表观基因组学数据的积累，不同标准（criteria）被应用于人类基因组中GSH的全基因组搜索。一般来说，这些标准要求与功能DNA元件，例如启动子、增强子和编码序列之间有最小线性距离。但选择的距离通常是任意的，基因组的位点特异性特征没有被考虑。此外，目前大多数方法仅基于基因组特征，没有考虑组织特异性的基因表达和调控元件。将人类基因组的三维染色质组织和组织特异性表达模式考虑在内，可以克服这些限制，更好地定义GSH。
研究团队的目标是确定满足基因组工程两个主要标准的基因组位点：对宿主细胞正常功能的影响最小，并保持稳定的转基因表达。因为常见的pMEI，特别是健康人基因组中AF高的pMEI，可以隐藏大量插入而没有明显的有害影响，因此研究团队推断这些pMEI位点是GSH选择的合理候选者（图1）。从常见的pMEIs中，基于表达定量性状位点（eQTL）分析，研究团队剔除了与组织特异性基因表达相关的pMEI。
图1.总体基因组安全港识别策略的示意图。
为了评估转基因和宿主细胞基因组之间的潜在相互作用，研究团队使用全基因组Hi-C和启动子捕获Hi-C等技术识别基因组空间邻近信息。为了避免可能降低转基因整合和转录效率的异染色质区域，抑制和静止状态标记的基因组区域也被排除在外。据报道，活性染色质区域与转基因的高编辑效率和表达有关。因此，研究团队进一步标记与活性染色质标记重叠的GSH位点。
研究团队在1000 Genomes计划中利用新开发的框架鉴定确定了常见的pMEI，并在这些常见的pMEI和匹配的类淋巴母细胞系全基因组表达谱之间进行了eQTL分析，最终确定了血细胞中的16个候选GSH，其中有15个位于内含子区，1个位于基因间区。所有GSH都位于活跃的染色质区，其中13个位于GM12878细胞拓扑关联结构域外。
为了验证新开发框架的可重复性，研究团队利用来自GTEx项目的血细胞pMEI相关eQTL数据集进行了类似分析。在GTEx数据集中，研究人员新开发的框架确定了9个候选血液GSH。其中6个位点与1000 Genomes计划数据中确定的GSH重叠。两个独立数据集之间高度一致的结果进一步证实了新开发框架的稳健性能。
图2.血液和大脑中GSH候选位点附近的表观遗传和染色质相互作用。
研究团队利用GTEx pMEI和脑特异性基因表达数据、表观遗传图谱和3D染色质组织图谱绘制了脑细胞中的GSH，最终确定了5个候选GSH位点。与在血细胞中鉴定的GSH相似，所有脑GSH都位于内含子区域并标记为活性染色质区域。在脑细胞和血细胞中鉴定的GSH彼此独特，突出了GSH组织特异性作图的重要性。
图3.GSH在HUDEP2细胞中的实验验证。
基因组工程技术在过去十年中发展迅速。基因和细胞疗法有可能治疗曾经无法治愈的疾病。但人类基因组的功能尚未被完全了解，避免重要基因组区域的意外变化仍然是基因组工程期间的主要考虑因素。该研究团队开发了一个计算工具（GEG-SH mapper），可识别用于基因治疗和基因组工程研究的组织特异性GSH位点，并证明了其在血液和大脑中的效用。研究团队在血液中发现了19种GSH，在脑组织中发现了5种GSH，并验证了其中3个GSH位点。
“我们已经创建了编辑基因组的谷歌地图，”联合通讯作者Yong Cheng博士表示。“有了这个工具，研究者可以利用一种新的方法来确定安全整合基因的位置。通过我们创建的流程步骤，可以很容易地在特定组织中找到‘安全的避风港’。结合快速发展的基因组工程技术，我们的方法有可能在不久的将来提高基因和细胞疗法的整体安全性和效率。”
1.Shrestha, D., Bag, A., Wu, R. et al. Genomics and epigenetics guided identification of tissue-specific genomic safe harbors. Genome Biol 23, 199 (2022). https://doi.org/10.1186/s13059-022-02770-3
2.Research team finds new way to identify 'safe harbor' for gene therapies
https://medicalxpress.com/news/2022-09-team-safe-harbor-gene-therapies.html
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