MACHETE是“Molecular Alteration of Chromosomes with Engineered Tandem Elements”的首字母缩写。MACHETE的出现意味着，第一次有了一种直接有效的方法来研究实验室模型中的CNA缺失。

研究团队利用工程串联元件开发了MACHETE技术（图1）。首先，通过CRISPR促进同源定向修复，将一个编码串联阴性和阳性选择标记扩增插入目标区域，然后通过阳性选择富集整合细胞。其次，引入一对针对预期删除断点的单导向RNA （sgRNA），然后进行负选择。MACHETE通过对选择靶点的PCR扩增引入40 bp的同源臂来生成供体DNA，与带有sgRNAs的Cas9的核糖核蛋白（RNPs）耦合。

癌症中的染色体9p21.3缺失几乎无一例外地影响肿瘤抑制基因CDKN2A。研究团队将MACHETE应用于胰腺癌同基因小鼠模型进行了9p21.3缺失研究（图2）。9p21.3缺失可以包含额外的基因，包括16个I型干扰素簇。TCGA数据分析显示，在超过10%的病例中，有14种不同的肿瘤类型存在9p21.3纯合子缺失。研究团队进一步将9p21.3缺失分为仅针对CDKN2A/B的缺失和通常包含整个I型IFN簇的大事件（9p大或9pL）。根据肿瘤类型的不同，9pL事件发生的频率在20-60%之间，其中胰导管腺癌（PDAC）的发生率最高。

为了分析4C4缺失影响PDAC表型的机制，研究团队对大块ΔL和ΔS肿瘤进行RNA-seq，并使用CIBERSORT41评估信号通路和免疫细胞组成。相对于ΔS肿瘤，ΔL肿瘤显示与IFN信号通路相关的通路减少，以及免疫信号的广泛耗尽，包括B细胞和T细胞群。RT-qPCR证实，ΔL肿瘤中I型ifn（Ifnb1和Ifne）和ifn响应基因（Oasl1和Isg20）mRNA水平降低。从ΔS和ΔL肿瘤分离的肿瘤浸润CD45+细胞的单细胞RNA测序（scRNA-seq）发现了多种免疫细胞群丰度的变化（图4）。ΔL肿瘤有较少的B细胞和髓样细胞，伴随着CD8+ T细胞的增加。

图3.4C4/9p21.3缺失基因型决定I型IFN信号通路和免疫浸润。

由于不同I型干扰素之间的功能冗余性仍然知之甚少。例如，Ifnb1在免疫细胞中高度表达，是cGAS-STING通路参与先天和适应性免疫的关键效应因子，但大多数其他I型ifn对免疫的相对贡献尚不清楚。为了分析不同肿瘤来源的IFN对免疫编辑和转移的功能贡献，研究团队利用MACHETE设计了一个细化的缺失系列，其中包含逐渐增加的IFN基因，类似于在癌症患者中看到的缺失。

研究发现，I型IFN簇与CDKN2A/B共同缺失，几乎一半的肿瘤含有9p21.3缺失，而其他9p21.3基因如Mtap 46也可能影响肿瘤行为，I型干扰素是关键的肿瘤抑制因子。因此，9p21.3缺失不仅无法有效阻断肿瘤细胞增殖，而且有助于免疫逃逸，同时破坏细胞内在和细胞外在的肿瘤抑制程序。

虽然CNA在癌症中普遍存在，但它们的功能表征一直受到控制大型基因组区域难度的限制。MACHETE解决了这一挑战：这是一种可定制的有效方法，可删除至少45 Mb，不需要克隆的目标载体，消除细胞与脱靶整合，并允许工程等位基因系列删除。

将MACHETE应用于胰腺癌同源小鼠模型，发现IFN簇的共同缺失促进了免疫逃避、转移和免疫治疗耐药性。研究结果指出I型IFN缺失是癌症中免疫逃避的普遍遗传机制，与人类白细胞抗原（HLA）簇缺失相媲美。9p21.3的缺失不仅使抑制细胞增殖的有效屏障失效，而且还促进了免疫逃避，同时破坏了细胞内源性和细胞外源性的肿瘤抑制程序。CNA缺失与多种人类遗传疾病有关，MACHETE为研究癌症以外的大型基因缺失事件提供了一个新的框架。

参考资料：

Barriga, F.M., Tsanov, K.M., Ho, YJ. et al. MACHETE identifies interferon-encompassing chromosome 9p21.3 deletions as mediators of immune evasion and metastasis. Nat Cancer (2022). https://doi.org/10.1038/s43018-022-00443-5

https://doi.org/10.1038/s43018-022-00443-5