文章发表于Nature Communications

研究团队通过精确的HiFi长读长、Hi-C长读长测序技术对黑色素瘤COLO829癌症细胞系进行测序（图1）。此外，研究团队还开发了一种基于图的计算工具pstools，可处理多种不同的数据类型，并将其整合在联合序列空间中，能够保留不同层次的基因组复杂性以直接产生完整的phased基因组。该方法还可以有效地表征重复区域中的SV，在碱基和单倍型分辨率上优化了癌性突变的特征，并且可以在全染色体水平上进行多倍体定相（phasing）。

研究团队将pstools方法应用于COLO829的体细胞和胚系细胞，在全基因组上以碱基分辨率发现了166个体细胞结构变异（SSV）。将其与使用其他技术观察到的SSV进行对比（图1b），结果显示，pstools方法在碱基和单倍型分辨率上提供了更精确的SV表征。上述结果表明，与短读长测序技术相比，pstools方法可以在重复区域中表征更精确、全面的单倍型SV图谱。

图2详细介绍了pstools算法的工作流程，其有效结合了HiFi和Hi-C技术的优势，能准确地解离染色体以及连接染色体臂，可用于表征染色体间和染色体内结构序列事件，为常规临床应用生成准确、连续和完整的复杂癌症单倍型基因组。

研究团队在健康人体样本（HG002、HG00733和PGP1）上对pstools方法进行了基准测试，标准评估指标包括：NG50、switch/hamming误差以及总序列长度。结果显示，pstools算法生成了scaffold>6.0Gb的高质量组装 ，NG50组装>130 Mb。相比之下，使用hifiasm（Hi-C）方法生成的NG50组装＜52 Mb，表明其不适用于染色体水平的基因组学研究。此外，pstools的组装质量较高，相位精度超98.5%，组装耗时较短，在12 h内就能完成（trio-hifiasm+salsa2方法耗时更长＞2天）（表1）。

为确认是否出现组装错误，研究团队使用Grch38作为参考序列，使用minimap2对上述组装进行比对操作，对scaffold进行了评估（图3）。结果显示，所有contig都被正确地分配到染色体中，与triohifiasm+salsa2相比，pstools方法可以产生高质量的phased scaffold。

研究团队还在COLO829癌症细胞系上对pstools方法进行了基准测试，并使用最先进的HiFi contigger（Hifiasm）和Hi-C scaffolde（salsa2）方法进行了独立对比实验。结果显示，Hifiasm+salsa2方法不能在染色体水平上重建phased基因组。相比之下，pstools方法不需要任何亲本信息，就能在染色体水平上产生兼具完整性、准确性和连续性的高质量组装（NG50 > 130 Mb）。此外，在碱基分辨率下，研究团队通过pstools共发现了19,956个插入、14,846个缺失、421个重复、52个倒置和498个易位，表明其能够鉴定复杂癌症基因组的单倍型SV（胚系和体细胞）并进行表征。

研究团队将通过pstools方法得到的高置信度SV调用集与其他多种技术（PacBio-CLR、Nanopore、PacBio-HiFi和短读长测序）得到的SV调用集进行了比较。结果显示，pstools方法的F1评分为93.9%（精确率96.0%，召回率91.9%），而基于Dipasm、Hifiasm+salsa2和Hifiasm+3D-DNA方法的F1评分<82%。与现有方法相比，pstools方法在癌症基因组学研究中更具优势。

有趣的是，pstools方法还能够检测到10号染色体上PTEN的纯合12kbp缺失（图4），可以发现由于同一或不同染色体上多个事件组合而产生的“断裂-融合-桥”（BFB）循环事件的SV。例如，研究团队在第15号染色体上发现了一个已知的BFB事件，该事件来自第6号和第20号染色体的插入。

综上所述，该研究将高分辨率测序技术（HiFi和Hi-C）应用于COLO829癌症系，并开发了一种快速、准确的计算方法pstools，其性能优于现有方法trio-hifiasm和salsa2，有助于精确发现SV、重建染色体水平单倍型基因组，为分析单个患者的全谱SV提供了有效且简化的方法。此外，pstools方法能够产生高质量的胚系SV调用集，为临床医生提供了一种简单的方法来分析患者的SV，有助于更好地对患者进行诊断和疾病管理，包括预测治疗反应。