检测同一细胞中的多个参数是准确理解生物系统及其在疾病期间变化的关键。在环状DNA的研究中，将DNA与转录组信息相结合以评估其对细胞的功能影响至关重要。近年来，表征单细胞中多种特征的技术不断发展，但目前的方法仍难以深入表征单细胞中的环状DNA含量、结构和序列。在癌症中，染色体外环状DNA（ecDNA）是癌基因快速扩增的载体，在有丝分裂期间具有独特的复制、不均等分离能力，进而造成了细胞间拷贝数异质性，这种异质性使肿瘤能够适应和逃避治疗。此外，ecDNA还与肿瘤的侵袭性和耐药性有关。但迄今为止，人们对ecDNA的起源、结构动力学及其对肿瘤内异质性影响的了解仍不全面。
近日，德国柏林夏瑞蒂医科大学、洪堡大学的研究团队合作在Nature Genetics发表了题为“Parallel sequencing of extrachromosomal circular DNAs and transcriptomes in single cancer cells”的文章。研究团队报告了单细胞ecDNA和转录组平行测序技术 “scEC&T-seq”，能够平行检测单细胞中所有环状DNA类型以及全长mRNA，且不受其大小、含量和拷贝数的影响。该研究结果证明了scEC&T-seq在分析含有结构复杂的多片段ecDNA和小环状DNA的单个癌细胞时的效用性。
文章发表在Nature Genetics
研究团队在单细胞中对scEC&T-seq方法进行了基准检测。首先使用流式细胞分选术（FACS）将神经母细胞瘤（NB）癌细胞分离到96孔板中；然后将DNA从聚腺苷酸化的RNA中分离出来，对其进行核酸外切酶酶切以富集环状DNA；最后分析了环状DNA的序列组成，并使用先前建立的计算方法推断了环状区域的基因组来源。
为评估scEC&T-seq方法的性能，研究团队首先评估了其对线粒体DNA（mtDNA）的检测和富集。mtDNA存在于所有细胞中，可作为阳性对照。结果显示，映射到mtDNA的reads百分比显著增加，其他环状DNA情况也相同，表明环状DNA实现显著富集。此外，研究团队还评估了细胞周期特征基因表达，以检测通过scEC&T-seq能否得到高质量的mRNA测序数据。结果显示，由scEC&T-seq推断的细胞周期分布与使用基于FACS检测的细胞周期分布相匹配，证实了该方法的准确性。上述结果表明，scEC&T-seq不仅能够从单细胞中分离、检测并特异性富集环状DNA，还可以并行测序癌症单细胞中的高质量、完整的转录本mRNA。
图1. scEC&T-seq能够富集和检测单细胞中的环状DNA。来源：Nature Genetics
研究团队探索了scEC&T-seq能否提供ecDNA结构相关信息。结果显示，scEC&T-seq在几乎所有单细胞中都捕获了多片段ecDNA，重现了先前在大量群体中发现的元件结构。通过对ecDNA连接跨reads和结构变异（SV）进行量化，研究团队基于短读长和长读长测序证实了上述片段的互联性，并发现scEC&T-seq可以在单细胞中鉴定融合转录物。综上，scEC&T-seq检测ecDNA相关SV和单细胞中由此产生的融合基因表达的灵敏度较高。
图2. scEC&T-seq可捕获单个癌细胞中多片段ecDNA的复杂结构。来源：Nature Genetics
ecDNA的不平等有丝分裂分离意味着ecDNA拷贝数在单个细胞之间可能存在很大差异。在大多数单细胞中，多片段ecDNA在结构和组成上没有差异，表明ecDNA在培养细胞系中结构稳定。但少数细胞只包含独立ecDNA的一个子集，这意味着ecDNA含量的变化可能导致了种群异质性。
研究团队分析了ecDNA拷贝数异质性是否影响ecDNA上的编码基因表达。结果显示，相对ecDNA拷贝数分布与基于FISH检测的拷贝数分布一致。SNP分析表明，ecDNA在癌症单细胞中都是单等位基因来源。此外，与拷贝数驱动的基因表达差异一致，相对ecDNA拷贝数与同一单细胞中ecDNA上所含基因的mRNA reads数量呈正相关。上述结果表明，ecDNA拷贝数异质性是细胞间癌基因表达差异的主要决定因素。
图3. 细胞间ecDNA含量差异驱动基因表达的差异。来源：Nature Genetics
此外，研究团队在合并的单细胞scEC&T-seq数据上应用了SNV检测算法，将检测到的SNV与大规模群体的全基因组测序鉴定的SNV进行了比较，发现scEC&T检测的大多数SNV也在全基因组中检测到（> 69.5%）。
因为scEC&T-seq也检测mtDNA，研究团队假设异质性线粒体突变可以进行谱系追踪。结果显示，通过同质mtDNA变异体进行的无监督等级聚类准确地对细胞进行了基因分型，mtDNA上的异质SNV揭示了高度的细胞间异质性。因此，scEC&T-seq可以检测mtDNA和ecDNA中的异质性变异，允许广泛的SNV检测应用和分析，包括谱系推断。
研究团队将scEC&T-seq应用于两个神经母细胞瘤单细胞和两个不同患者来源的活T细胞中。与正常T细胞和细胞系细胞相比，癌细胞中环状DNA的数量显著较高，表明肿瘤中的DNA环状化比未转化细胞或培养细胞更频繁。环状DNA的大小分布和相对基因组含量与在细胞系中观察到的相当，表明不管检测样本如何，scEC&T-seq均可重复捕获环状DNA。
研究团队在两名患者几乎所有癌细胞中都检测到含有致癌性MYCN基因的ecDNA，并在细胞系中观察到MYCN转录的细胞间差异与相对ecDNA含量呈正相关。上述结果表明scEC&T-seq可以成功地应用于人类肿瘤的研究中。
图4. scEC&T-seq在单细胞水平检测原发性神经母细胞瘤中的环状DNA。来源：Nature Genetics
该研究证明通过对单个癌细胞的环状DNA和转录组进行平行测序，scEC&T-seq不仅可以很容易地区分ecDNA驱动的细胞间癌基因拷贝数异质性的转录后果，并具有揭示ecDNA结构进化原理的潜力。在单个癌细胞中进行scEC&T-seq能够独立于拷贝数和环状DNA大小来描绘它们的环状DNA含量，并在活的单细胞中发现了小的环状DNA，表明凋亡不是它们产生的唯一机制。scEC&T-seq适用于多种生物系统，通过该方法对细胞环状DNA含量和转录组的综合分析，可进一步探索单细胞中环状DNA的多样性和不变性。scEC&T-seq将帮助人们更全面地了解环状DNA在癌症及其他疾病中的范围、功能、异质性和进化，其在未来有望成为许多其他领域研究的重要手段。
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