近日，西班牙Vall d'Hebron肿瘤研究所、伦敦大学学院癌症研究所和美国威尔康奈尔医学院的研究团队合作在Genome Medicine发表了题为“ACT‑Discover: identifying karyotype heterogeneity in pancreatic cancer evolution using ctDNA”的文章。研究团队开发了一种基于ctDNA检测的新方法ACT-Discover（Aneuploidy in Circulating Tumour DNA），能够利用匹配的肿瘤活检样本或PDX的单倍型定相（haplotype phasing），以较高的灵敏度识别SCNA，揭示了单一空间和时间snapshot上无法识别的正在进行中的获得性亚克隆改变。结果显示，在28个可评估的cfDNA样本中观察到SCNAs。在这些事件中，30%只能通过利用ACT-Discover方法来识别。此外，研究团队还通过ACT-Discover表征了晚期胰腺癌的演变。

文章发表在Genome Medicine

研究团队设计了一项前瞻性临床实验，共招募到24例晚期胰腺癌患者采集了转移灶样本。该队列患者从转移灶活检之日起的中位生存期为264天。对来自上述24例患者的87份肿瘤样本进行全外显子组测序（WES），包括2个原发瘤、22个转移瘤、8个PDX和55个cfDNA样本以及24份胚系样本。最终，共有19例患者的75个肿瘤样本（2个原发瘤、18个转移瘤、8个PDX和47个cfDNA样本）可用于后续分析。

图1. 研究队列概况。来源: Genome Medicine

研究团队使用改良版PyClone对可评估患者队列的基因突变进行聚类，以解决基因组事件的克隆状态，并重建肿瘤的亚克隆结构。19位可评估患者的中位突变数为84，克隆突变的数量小于亚克隆突变的数量。（图2）

基于已知的癌症基因（包括泛癌和胰腺癌基因），研究团队分析了上述患者队列中假定的驱动因素。结果显示，大多数患者存在高可信度的KRAS和TP53克隆驱动突变，这些基因中没有检测到亚克隆突变。对19例肿瘤进行核型分析，发现SCNA通常在包含驱动突变的基因组位点上被检测到；42%肿瘤中含有KRAS癌基因的12p染色体区域出现增益；38%病例中发生亚克隆突变。

研究团队对可评估患者队列进行分析，表征了反映肿瘤演化过程（包括内源性和外源性）中的活性突变特征，发现大多数突变都是时钟样突变过程（例如SBS1和SBS5），这与先前报道一致。

图2. 研究队列的基因组特征。来源: Genome Medicine

为评估ctDNA在监测胰腺癌持续演变方面的价值，研究团队从19位患者中选取了一系列血浆样本进行WES，并开发了定制的分析框架ACT-Discover，以检测ctDNA并表征其中的基因组变异。随后，采用两步筛选法来检测ctDNA中的突变和SCNA进行分析。

研究团队使用来自患者肿瘤的真实数据对ACT-Discover的性能进行验证，检测了ACT-Discover在不同纯度样本中识别等位基因失衡的能力。结果显示，在来自患者PAN104的PDX样本测序数据中，65%的基因组被确定为等位基因失衡；在模拟纯度为10%时，97%的等位基因不平衡仍被检测到；即使在1%的模拟纯度下，也可以检测到20%的等位基因不平衡。上述结果表明，ACT-Discover可以从ctDNA含量约为1%的cfDNA样本中阐明与肿瘤非整倍体相关的大量信息。

此外，ACT-Discover能够在较低阈值下识别SCNA。值得注意的是，研究团队发现，只有通过单倍体分型才能检测到中位数100%、平均值82%的SCNA（包括22个cfDNA样本中的每个SCNA），在未使用ACT-Discover的情况下，有些SCNA会被遗漏。

图3. 体细胞突变和拷贝数改变的肿瘤信息分析。来源: Genome Medicine

ACT-Discover可在一小部分患者的疾病过程中，详细表征点突变及SCNA水平上的体细胞基因组变异的进化动态。因此，研究团队将其应用于真实患者病例中。患者PAN113表现为转移性胰腺癌。根据ASCAT，在诊断后31天、接受全身抗癌治疗之前，研究团队采集了该患者的转移灶活检样本和ctDNA样本，发现分别有51%和82%的基因组存在等位基因失衡。此外，转移性活检样本和ctDNA样本的核型之间存在拷贝数异质性，影响了约22%的基因组。

值得一提的是，镜像亚克隆等位基因失衡（MSAI）在两个基因组位点上被发现：4q染色体的一部分和2号染色体p臂上的一个焦点片段，表明可能存在平行进化和选择对克隆适应性进行持续优化。

在诊断后第50天和第137天，研究团队连续采集了患者PAN113的ctDNA活检样本，观察到突变和SCNA的进一步演变。在染色体臂11q和12p上发现了MSAI，表明该患者在治疗过程中持续进行克隆进化和潜在的SCNA选择，提示可能发生了核型重塑。

最后，研究团队使用液体活检样本检测了15例患者的拷贝数信息，其中13例表现出核型异质性，受等位基因失衡影响的基因组中位数为26.6%。这突出表明核型异质性在胰腺癌中相对普遍，其普遍性与采样的程度密切相关。

图4. 胰腺癌患者SCNA的异质性。来源: Genome Medicine

液体活检和ctDNA分析已成为肿瘤患者分层和检测微小残留病研究的重要生物标记物，其在肿瘤进化的研究中也显示出令人信服的效用。研究团队开发了一种新颖的方法ACT-Discover，利用来自肿瘤、PDX或高纯度cfDNA样本的等位基因特异性单倍体分型，可识别跨时间、空间样本之间等位基因不平衡的异质性，以探索正在进行的肿瘤演化。该研究结果强调了跨越时间和空间的采样方法在癌症研究中的重要性，以及基于ctDNA的方法在记录肿瘤演化过程中的重要性，并揭示了晚期胰腺癌的肿瘤内部异质性。

文章通讯作者Rodrigo A. Toledo表示：“在治疗前通过液体活检进行ctDNA分析，并在整个疾病过程中进行系列分析，使我们能够识别和跟踪胰腺癌中发生的遗传或分子改变。这项技术正应用于多种不同肿瘤类型，以识别能够极大地影响药物敏感性的突变，从而帮助指导治疗决策。”

共同通讯作者Manuel Hidalgo补充道：“能够以非侵入性的方式获得遗传和基因组的见解，并在整个疾病过程中持续进行检测，ACT-Discover为胰腺癌以及其他越来越多的肿瘤类型提供了更多有价值的信息。”