近期，瑞典乌普萨拉大学等多个机构的研究人员在Nature Communications发表了题为“Long-read whole-genome analysis of human single cells”的文章，提出了一种新的人类单细胞长读长全基因组分析方法。利用基于PacBio高保真（HiFi）测序平台的长读长测序，对人类单个CD8+ T细胞进行WGS分析，并通过多重置换扩增（MDA）获得足以进行长读长测序的DNA。结果表明，与短读长测序相比，长读长测序可提高单细胞遗传变异检测的性能，特别是检测单倍型、复杂结构变异和串联重复序列（TR）；并证明从头重建部分人类T细胞基因组是可行的。

研究团队利用单细胞全基因组扩增技术（WGA）与PacBio HiFi WGS相结合开发了基于液滴的MDA技术（dMDA），对CD8+ T细胞进行分析（图1）。该单细胞WGS的具体工作流程如下，通过流式细胞荧光分选技术（FACS）分离单细胞，并将其放入含有裂解缓冲液的孔中，以便裂解细胞并释放DNA片段。随后，将DNA分子封装在约50000个液滴中，在每个液滴内发生dMDA反应。在dMDA反应过程中形成分子间嵌合体的风险大大降低，在含有单个DNA片段的液滴中，这种风险被完全消除。因此dMDA方法能够保留分子长度并减少扩增偏差。dMDA反应完成后，扩增的DNA可用于制备短读长或长读长测序文库。

在该研究中，来自同一人类供体的两个单独的CD8+T细胞（A和B）在体外进行克隆扩增，所得细胞集合用作WGA和测序的起始材料，并使用Illumina和PacBio全基因组测序分析来自克隆A和B的单细胞。

研究团队使用Illumina WGS分析了来自T细胞克隆A和B的16个单细胞DNA样本，其中8个样本使用dMDA进行扩增，其余8个样本则进行标准MDA处理。测序结果显示，与8个MDA样本相比，8个dMDA样本显示出更均匀的覆盖范围。在MDA样本中，68.9%的reads与≥200×覆盖率区域匹配，dMDA样本中仅为16.0%。对于完整的单细胞数据集，研究团队进一步量化了全基因组的覆盖率变化，发现MDA的标准差是dMDA样本的2.46倍。综上，与常规MDA相比，dMDA提供了更高的测序覆盖率均匀性。

研究团队使用5个dMDA单细胞样本（2个来自T细胞克隆A，3个来自T细胞克隆B）进行PacBio长读长测序。结果显示，PacBio平台获得平均15.7Gb数据，Illumina平台获得48.7Gb数据。随后研究团队将该数据用于单细胞SNV调用，发现PacBio单细胞测序检测到的胚系SNV数量与Illumina相似。

进一步，研究团队估计了SNV调用的精确度和灵敏度。结果显示，PacBio单细胞SNV调用精确度高于Illumina dMDA，但灵敏度略低。在这些变异中，有6,336个位于先前报道的与人类健康相关的“暗”基因区域。值得注意的是，PacBio数据提供了数千碱基的相位信息，这使得将单细胞中检测到的变异分配给其中一种单倍型成为可能，凸显了长读长测序在单细胞水平上识别和分析体细胞变异的优势。

研究团队使用Sniffles从PacBio数据中调用SV，发现平均每个单细胞有3,493个缺失、4,636个插入、903个重复和 19,373个倒位。由于微流控平台的缺陷，其中绝大多数SV可能源自嵌合dMDA分子。研究团队将样本间SV进行合并，以识别真正的SV，结果显示每个单细胞平均检测到5,473个真实SV，其中2510个缺失、2957个插入。

为进行比较，研究团队也对Illumina dMDA样本进行了SV分析（图4），平均检测到327个真实SV。PacBio测序检测的单细胞真实SV数量是Illumina的16倍多。PacBio检测的SV中，缺失和插入的精确度分别为0.73和0.66，其灵敏度略高于0.20；重复和倒位的精确度接近于零，表明几乎所有此类事件都源自嵌合分子。真正的PacBio SV主要由长达1kb的插入和删除组成，具有代表ALU重复元件的约300bp的清晰峰。

此外，研究团队发现在PacBio单细胞数据中检测到的一些SV在Illumina批量数据中很难被识别。PacBio数据不仅使人们能够确定这些SV在单细胞中的确切断点，还能够通过附近杂合SNV的定相来重建单倍型。

假设通过PacBio reads可研究单细胞中的TR，为证明上述观点，研究团队使用串联基因型进行TR调用（图6）。首先提取Pacbio批量数据中所有纯合或杂合的TR，共发现15,098个此类重复元件。在单细胞中，平均有4,770个TR等位基因可以被正确地进行基因分型，其重复序列大小与批量样本一致。其中，最长的重复序列比参考基因组长662bp，主要由二核苷酸AT序列组成，这是在短读长数据中难以解析的区域。

PacBio HiFi reads是生成高质量人类基因组组装的理想选择，为研究单细胞基因组的区域在多大程度上可以被重新构建，研究团队选择了克隆A和克隆B中覆盖率最高的两个单细胞（A1、B1），使用Hifiasm对其进行了单独的从头组装。结果显示，T细胞A1和B1分别生成598.3Mb和454.1Mb的初级片段；序列N50值分别为35kb 和42kb ，其中最大的序列N50值为578.3kb。

研究团队进一步分析了BUSCO基因模型，发现在T细胞A1中，12.8%的基因（n=1,762）被完全组装；在T细胞B1中，9.0%的基因（n=1,236）被完全组装。

综上所述，研究团队通过将自动化单细胞处理和基于液滴的WGA方法与PacBio HiFi测序相结合，能够对单个人类T细胞的长DNA片段进行测序。与短读长测序技术相比，PacBio长读长测序使每个单细胞的基因组覆盖率高达40%，从而能够检测SNV、SV和TR以及人类基因组的“暗”区域。该研究共检测到28例体细胞SNV，5,473个高置信度SV。此外，单细胞从头组装产生了高达598Mb的基因组和1762（12.8%）个完整的基因模型。总之，与短读长测序技术相比，长读长测序改进了对遗传变异的分析，包括人类基因组的“暗”区域，甚至能够从头组装部分单细胞基因组，长读长测序在表征单细胞的全谱遗传变异方面的前景。