结直肠癌（CRC）是最常见的胃肠道恶性肿瘤之一，其死亡率较高。已有研究证据表明，CRC中存在AS改变，异常AS也与CRC癌变有关。但迄今为止，CRC的RNA剪接图谱尚未得到充分探索。因此，全面描述AS的情况及其生物学意义有助于了解AS在CRC中的重要性。此外，对新型剪接事件和潜在调控机制的分析可能为开发CRC的新治疗策略提供新的见解。
近期，徐州医科大学的郑骏年、董东和苏州大学第一附属医院支巧明团队合作，在Genome Medicine上发表了题为“Long-read sequencing reveals the landscape of aberrant alternative splicing and novel therapeutic target in colorectal cancer”的文章。研究团队使用长读长测序和短读长测序平台对CRC中的AS事件进行系统全面分析，发现了数千个未加注释的剪接异构体，其中一些新的转录本与CRC患者的生存密切相关，拓宽了人们对CRC肿瘤发生的理解。此外，新发现的剪接异构体TIMP1Δ4-5在介导CRC进展中发挥着重要作用，可能是CRC的潜在治疗靶点。
文章发表在Genome Medicine上
研究团队收集了78例CRC患者的癌组织和10例癌旁正常组织，利用ONT长读长测序平台和Illumina短读长测序平台解析CRC转录组（图1A），最终获得792万个ONT长reads，每个样本的平均reads长度为1.02 kb，为分析CRC转录组的复杂性提供了可靠和有价值的资源。
接下来，依据参考转录组（GENCODE v34），研究团队共鉴定出90,703个转录本（图1B），被定位到18,024个注释基因和2796个新基因位点，近60%的基因有两个或更多的转录本（图1C）。这些转录本主要为4种类型，37%为FSM、40%为NIC、17%为NNC以及0.2%为ISM。与当前转录组数据库相比，超62%转录本是全新的（主要为NIC和NNC）。进一步分析发现，这些新的转录本可能是样本特异性的，其能够在相对较低的水平上表达更多的外显子。
图1.ONT测序鉴定CRC中的新转录本。
图2. 长读长ONT新转录本特征。
研究团队使用SUPPA2软件对基于ONT长读长测序数据的AS事件进行注释，量化了7种不同类型AS事件的水平，即SE、A3、A5、AF、AL、RI和MX，共发现2,363,976例AS事件，其中AF事件占大多数。随后，研究团队对上述AS事件进行了严格筛选，最终获得1,085,182例，组成AS事件数据集。
上述研究发现表明，在CRC中，DEAS事件可能通过与多种癌症相关途径相互作用而发挥复杂的作用。
图3.CRC中选择性剪接事件的鉴定。
AS事件具有高度可变特征，研究团队探究了其能否作为CRC中新的预后生物标志物，使用单因素Cox分析来评估总生存率与各DEAS事件之间的相关性。结果显示，1,472个DEAS事件（共1,241个基因）与CRC患者的预后密切相关，其中，809例与预后良好相关，663例与预后较差相关。值得注意的是，38个基因被确定为良好和较差预后的AS事件，发现了对应于27个不同基因的前30个DEAS事件，这些基因与CRC的总存活率相关。上述结果表明，DEAS事件可能是有价值的CRC预后生物标志物。
图4. 识别与CRC预后相关的DEAS事件
在已鉴定的DEAS事件中，研究团队发现了许多新的剪接异构体，其可能是患者生存的重要决定因素。其中，新鉴定的剪接异构体TIMP1Δ4-5在CRC中显著下调，表明其在CRC肿瘤发生中起重要作用。进一步体外和体内实验证明，TIMP1Δ4-5的异位表达显著抑制了肿瘤细胞的生长、转移及侵袭。此外，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1（SRSF1），通过维持TIMP1Δ4-5的内含而发挥肿瘤剪接调节作用。
已有文献报道，全长TIMP1（TIMP1-FL）表达与人结直肠癌的肿瘤发生和转移相关，研究团队分别在CRC及CRC细胞系中过表达TIMP1Δ4-5和TIMP1- FL，以研究其在CRC中的单独作用。结果显示，与TIMP1Δ4-5作用相反，TIMP1- FL过表达显著提高了CRC细胞的生长、迁移能力。
图5. TIMP1Δ4-5和TIMP-FL在CRC癌变中具有相反作用
基于上述结果可知，介导剪接异构体从TIMP1-FL向TIMP1 Δ4-5的转换对于CRC患者的治疗是必要的。先前研究表明，dCasRx靶向选择性剪接外显子侧翼的调节剪接位点可诱导外显子跳跃，因此可利用CRISPR/dCasRx系统来操纵TIMP1基因的选择性剪接。研究团队设计了6个gRNA，将dCasRx与每个gRNA转染到SW480细胞中，在48h后使用RT-PCR进行评估。结果显示，在体外培养的CRC细胞中，CRISPR/dCasRx系统能够有效诱导TIMP1的外显子4-5的排除，进而能够显著抑制CRC细胞的增殖、生长。
研究团队通过给裸鼠皮下注射SW480细胞，进一步在体内测试了这种基于CRISPR/ dCasRx的策略，发现dCasRx介导的外显子排除显著抑制了裸鼠的肿瘤生长。综上，该研究结果证明dCasRx能够在体内和体外高效编辑RNA，靶向TIMP1选择性剪接可能成为一种有效的辅助CRC治疗新策略。
图6.靶向TIMP1选择性剪接在CRC中的治疗价值
结语
异常的AS被认为是癌症发展的标志。研究团队将长读长测序和短读长RNA-seq方法相结合，描述了人类CRC中的AS图谱，揭示了CRC的转录组复杂性。该研究是迄今为止对CRC中全长转录本和剪接异构体多样性最全面的表征，发现了大量未被注释的新转录本。此外，研究证明了癌基因和肿瘤抑制基因在CRC样本中表现出显著不同的RNA亚型多样性，揭示了可能在致癌作用中起重要作用的新转录本。值得注意的是，新发现的剪接异构体TIMP1Δ4-5在介导CRC进展中起着重要作用，可能是CRC的潜在治疗靶点。
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