大熊猫是最具魅力的旗舰物种之一，其毛发特征是其引人注目的黑色和白色（以下简称黑熊猫）。但是在中国陕西省秦岭地区发现的棕色大熊猫推翻了人们的传统认知。自1985年第一只棕色大熊猫被发现以来，新闻已报道了11例记录。雄性棕色熊猫“七仔”是目前唯一一只圈养的棕色熊猫。棕色熊猫的反复出现意味着这种特征可能是可遗传的。
近日，中国科学院动物研究所等单位的研究团队通过遗传学手段分析了为什么有的熊猫毛发会是棕色。研究团队利用中国佛坪自然保护区野生大熊猫长期的生态学和遗传学研究资料，建立了两个棕色大熊猫的家系，并建立了棕色毛色的孟德尔遗传模式，确定了Bace2基因25bp缺失的候选突变为棕色大熊猫最可能的遗传基础，且通过多种技术进行了证实。该研究为进一步了解棕色大熊猫乃至野生动物毛色变异的遗传基础提供了理论依据，对稀有棕色大熊猫的科学繁育具有重要的指导意义。相关成果已发表在PNAS上，文章题为“Taking a color photo: A homozygous 25-bp deletion in Bace2 may cause brown-and-white coat color in giant pandas”。
黑色熊猫全身覆盖着黑色和白色的毛发，而棕色熊猫则有棕色和白色的毛发。为了研究黑、棕色大熊猫的毛发特征，研究团队采集了大熊猫的左前肢和左后肢毛发。利用透射电镜对黑色和棕色毛发高度着色的中间部分进行检查，发现黑色毛发的黑素体在横截面上呈近圆形，在纵截面上呈细长的椭圆形，棕色毛发的黑素体在横切面和纵切面上均呈现较小的圆形/椭圆形或不规则形状。统计分析显示，棕色毛发的黑素体平均比黑色毛发少22%，黑素体平均比黑色毛发小55%。
图1. 黑、棕大熊猫毛发检测
为了阐明棕色毛发的遗传结构，研究团队首先研究了棕色毛发的遗传模式，然后基于鉴定的遗传模式及其地理分布进行全基因组变异筛选以捕获与该表型相关的所有潜在变异。根据系谱，发现棕色是由常染色体隐性突变。
研究人员根据棕色大熊猫的隐性孟德尔遗传模式和地理分布，对35只深度重测序的大熊猫进行了全基因组筛查和分析，在常染色体上总共检测到18147295个短变异和116636个结构变异。筛选后发现有650个变异分布在七仔和丹丹（1971年出生，1985年在陕西秦岭佛坪国家自然保护区被发现，2000年去世）共有的38个血缘同源（Identity By Descent，IBD）片段上，其中只有2个IBD片段在蛋白质组编码区存在变异。一个IBD片段（Chr11：19539708-19920712183）在DNAJC 16基因中具有同义突变（c.48C>T），另一个片段（Chr 1：4221483-1993914）上Bace2基因的第一外显子中具有25bp缺失。
基因缺失可导致过早的终止密码子和随后的功能丧失。重要的是，据报道Bace2是色素沉着相关基因。先前的几项研究已经建立了Bace2基因和脊椎动物毛发色素沉着之间的联系。以上结果表明，Bace2突变可以影响脊椎动物的色素沉着，因此，棕色大熊猫的毛色变化可能归因于Bace2缺失突变。
图2. Bace2缺失突变的鉴定
DNA和RNA测序数据验证棕色熊猫中的Bace2缺失
随后，研究团队对秦岭和非秦岭黑熊猫群体的序列进行比对分析，发现除了丹丹和七仔是纯合突变体外，其余的黑熊猫都是纯合野生型。通过对来自黑熊猫和七仔的毛发样本进行RNA测序分析，发现七仔的Bace2第一外显子的纯合缺失，而在黑熊猫中没有发生缺失，证实了棕色熊猫中存在这种缺失。
此外，研究人员利用PCR和Sanger测序验证了192只大熊猫Bace2基因的缺失情况。结果表明，只有2只棕色大熊猫是纯合突变体（丹丹和七仔），4只来自秦岭的黑色大熊猫和1只杂交大熊猫为杂合子，其余均为纯合子野生型黑熊猫。值得注意的是，没有一个非棕色秦岭个体携带这种突变，这与棕色大熊猫只出现在秦岭的观察相吻合。
图3. Bace2缺失突变的验证
为了验证Bace2缺失导致的毛色效应，研究团队利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在黑色小鼠中去除了熊猫Bace 2基因缺失的正向序列。与野生型小鼠相比，78只纯合子突变小鼠毛色均为浅棕色。
为了确定基因敲除小鼠是否表现出与棕色熊猫相似的黑素体模式，研究团队首先在显微镜下检查了Bace2+/+和Bace2−/−小鼠毛发中黑素体在生长期和休止期的分布，发现Bace2−/−小鼠在两个时期都比Bace2+/+小鼠表现出更少的黑素体。
透射电镜观察显示，野生型小鼠中的黑素体数量是敲除小鼠的1.23倍。此外，野生型小鼠黑素体体积显著增大，平均为基因敲除小鼠的1.49倍。总之，研究结果表明，基因敲除小鼠比野生型小鼠具有更少更小的黑素体，这与在熊猫毛发样本中的观察结果一致。因此，以上结果支持Bace2缺失很可能是大熊猫棕色毛发的遗传基础的观点。
图4. Bace2敲除小鼠的表型分析
该研究表明，Bace2基因25bp的纯合缺失很可能导致大熊猫毛发色素减退，使毛发呈现棕色，并利用多种测序手段和小鼠模型进行了验证。该研究的突破之处在于发现一个基因的突变可以导致毛发颜色的变化，从遗传学角度解释了棕色大熊猫的出现。据悉，研究团队计划进一步探索这25个碱基对的缺失导致棕色毛发的内在机制。
论文原文：
Guan D, Sun S, et al., Taking a color photo: A homozygous 25-bp deletion in Bace2 may cause brown-and-white coat color in giant pandas. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Mar 12;121(11):e2317430121. doi: 10.1073/pnas.2317430121.
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2317430121
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