染色体外环状DNA（eccDNA）是一类游离于染色体外的环状DNA，广泛存在于包括人类的各种真核生物中，参与调控基因的表达、细胞增殖、DNA损伤修复、肿瘤发生等多个生物学过程；其不易被核酸酶降解，结构更加稳定。目前，研究eccDNA主要方法有DNA荧光原位杂交（FISH）、批量全基因组测序（WGS）和Circle-Seq三种。前两种方法只能检测来自相对较大的基因组区域丰富的eccDNA，Circle-Seq能够识别广泛的eccdna但需要较大数量的细胞进行测序分析。
因此，目前亟需开发通用、可扩展的方法来检测从组织活检中提取的单个细胞或细胞核中的eccDNA，以揭示eccDNA的生物学复杂性，并阐明其在患者来源肿瘤样本中的异质性。
近日，瑞典卡罗林斯卡医学院的科研人员在Nature Communications杂志发表了题为“scCircle-seq unveils the diversity and complexity of extrachromosomal circular DNAs in single cells”的文章。研究团队开发并验证了Circle-seq的单细胞应用scCircle-seq，该方法适用于非固定和固定的细胞或细胞核，包括从肿瘤活检组织中提取的细胞核。研究显示，大多数eccdna在同一类型的细胞之间高度可变，且更倾向于在扩增基因组区域形成；将scCircle-seq应用三种不同癌症类型肿瘤样本中，发现肿瘤特异性的ecDNA图谱和具有不同ecDNA基因组模式的亚克隆群。综上，scCircle-Seq是一种易于扩展、直接和通用的方法，有望揭示癌症中eccDNA的生物学复杂性和异质性。
文章发表在Nature Communications
主要研究内容
图1. scCircle-seq工作流程及数据验证。
图2. scCircle-seq鉴定的eccDNA的基因组分布。
接下来，研究团队将scCircle-seq与全长scRNA-seq方法Smart-seq2相结合，应用于三种细胞系（Colo320DM、HeLa 和PC3），检查了scCircle-seq检测到的eccDNA拷贝数与其所含基因表达之间的关系。分析显示，基因表达水平与 eccDNA拷贝数之间的相关性较低，但在含有已知致癌基因（如MYC）的大型ecDNA中，其拷贝数与单细胞中相同基因的表达水平呈正相关。
图3. eccDNA的细胞特异性。
研究团队还将LumB细胞和TNBC细胞中鉴定的CPRs与癌症基因组图谱（TCGA）数据库乳腺癌中鉴定的体细胞拷贝数改变（SCNAs）进行交叉分析。结果显示，与TNBC簇2细胞的CPRs相比，扩增区域在TNBC簇1 和LumB细胞的CPRs中显著富集。研究团队还分析了鉴定的eccDNA数量与给定基因组区域的拷贝数关系，发现CPRs的数量在二倍体和中等扩增区域没有显著差异，在扩增水平较高的区域明显更多。上述结果表明，肿瘤细胞的eccDNA分布情况反映出其SCNA情况，并且高度扩增的基因组区域可产生更多eccDNA。
图4. scCircle-seq在患者来源肿瘤样本中的应用。
结 语
综上所述，研究团队开发了scCircle-Seq方法，可以在单细胞水平上分析eccDNA的多样性和复杂性。scCircle-seq利用滚环扩增（RCA）和DNA缺口修复步骤来实现高检测灵敏度，不仅可以检测丰富的、包含癌基因的eccDNA，还可以检测罕见的eccDNA。特别地，scCircle-seq还简化了工作流程，降低了丢失低丰度eccDNA的风险。总之，scCircle-seq是一种可扩展的工具，可用于分析不同细胞和组织类型中eccDNA的复杂性，并有望进一步扩大eccDNA用于癌症诊断的潜力。
Chen, J.P., Diekmann, C., Wu, H. et al. scCircle-seq unveils the diversity and complexity of extrachromosomal circular DNAs in single cells. Nat Commun 15, 1768 （2024）. https://doi.org/10.1038/s41467-024-45972-y.
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