目前，碘染色内镜检查仍是诊断ESCC及其癌前病变的金标准，但其依从性低且成本较高，无法在实际临床环境中广泛应用。液体活检方法能够检测血浆游离细胞DNA（cfDNA）中的循环肿瘤DNA（ctDNA），为无创早期癌症检测提供了一个有前景的途径。近年来，随着cfDNA生物学的进步以及相关数据的增长，高精度检测肿瘤特异性改变成为可能，包括遗传学、表观遗传学和片段组学特征。此外，全基因组cfDNA甲基化也成为当前癌症检测最有希望的生物标志物，优于片段化特征和遗传变异，但基于甲基化的ctDNA检测方法仍存在一些挑战。
近日，中国医学科学院肿瘤医院刘芝华、陈洪岩团队与温州医科大学眼科医院苏建忠团队合作在Nature Communications上发表了题为“Multimodal analysis of cfDNA methylomes for early detecting esophageal squamous cell carcinoma and precancerous lesions”的文章。研究团队对来自230名非转移性ESCC或癌前病变患者和230名匹配健康对照（HC）的460份cfDNA样本进行全基因组亚硫酸盐测序（WGBS），并开发了一个扩展的多模态分析（EMMA）框架，可同时识别cfDNA WGBS数据中与癌症相关的cfDNA甲基化、拷贝数变异（CNV）和片段化特征。
结果显示，EMMA显著提高了ESCC的检出率，将AUC从0.90提升至0.99；并在验证队列中检测到87%的ESCC和62%的癌前病变，特异性>95%。综上，该研究证明了cfDNA甲基化组的多模态分析在ESCC早期检测和分子特征监测中的潜力。
文章发表在Nature Communications
为增强对ESCC的早期检测，研究团队基于“组织-cfDNA-组织”策略开发了EMMA框架（图1）。首先，通过配对的WGBS和全基因组测序（WGS）数据，从155例ESCC患者的原发肿瘤和匹配邻近非肿瘤组织中鉴定出ESCC来源的差异甲基化区域（DMRs）和CNVs。随后，检测cfDNA WGBS数据中ESCC来源DMRs和CNVs，并计算其中短cfDNA片段比例作为片段大小比（FSRs）。接下来，采用基于随机森林的机器学习框架，利用包含150例ESCC患者和150例匹配HCs的数据集，分别选择DMRs、DMRs+CNVs以及DMRs+CNVs+FSRs等特征构建了不同的诊断模型，评估其性能。此外，研究团队还将最佳DMRs与配对ESCC组织样本中基于多组学的综合分子亚型、肿瘤微环境（TME）、存活率和转录组特征相关联。
该研究涵盖多个研究队列（CHCAMS等），共纳入460名参与者，涉及ESCC、癌前病变（HGIEN、IEN）患者和230名HC，分为发现/训练队列、外部验证队列、癌前验证队列。在进行医疗干预前，研究团队从每位参与者身上收集了中位数为 2 mL 的血浆，并用WGBS评估了每位参与者的cfDNA甲基组，460份cfDNA样本的参考基因组覆盖率约为 89%，平均深度为9.51x。
图1：研究设计与患者招募。
为量化cfDNA样本中ctDNA的比例，研究团队使用计算框架计算了“cfDNA恶性比率”。在cfDNA中，通过比较CHCAMS中150例ESCC患者和150例HC的WGBS数据，鉴定了650个DMRs；随后计算每个样本中每个DMR的cfDNA恶性比率，并利用其生成预测模型。结果显示，有50个DMRs在区分恶性和良性血浆样本方面性能最好，因此选择这些DMRs构建最终预测模型——ESCC-cfMeth评分。在发现、外部验证及癌前验证队列，ESCC-cfMeth评分的AUC分别为0.90、0.89和0.87，准确性分别为82.33％、85.00％和78.00％。
在发现和外部验证队列中，ESCC患者的ESCC- cfmeth评分均显著高于HC。值得注意的是，癌前验证队列中IENs患者的ESCC-cfMeth评分也有所增加，但随着ESCC疾病进展，评分并未进一步增加，这意味着评分可以反映包括癌前病变在内的早期疾病的生物学特征，但不能作为肿瘤进展的指征。上述结果表明，cfDNA甲基化特征在ESCC诊断中具有可靠性和可解释性，且在ESCC进展中存在潜在功能相关性。
图2：ESCC的cfDNA甲基化标记及其检测性能。
除cfDNA甲基化标记外，研究团队还分析了cfDNA来源CNVs对ESCC诊断的价值：利用WGS数据作为金标准，在ECGEA队列中鉴定了ESCC来源体细胞CNVs；并开发一种基于WGBS的方法，识别组织和cfDNA样本中的复发性CNVs。结果显示，大多数在WGS数据中鉴定的CNVs，在组织样本的配对WGBS数据均被成功识别。
研究团队使用ichorCNA表征了cfDNA中的CNV概况，并重点研究了在≥3 cfDNA样本中出现复发性CNV的区域。与HC相比，ESCC患者中有153个区域的CNV事件发生率显著更高，包括111个扩增区域和42个缺失区域。值得注意的是，CNV事件的发生率从HGIEN开始逐渐增加，并与癌症分期和分级呈正相关。上述结果凸显了cfDNA中的CNV事件在健康个体中的高特异性，及其与肿瘤进展和晚期疾病的正相关性。
图3：回顾并分析cfDNA WGBS数据中的CNV事件。
为进一步揭示cfDNA的多模态特征，研究团队对发现队列中的cfDNA片段大小特征进行全面分析，通过评估cfDNA中短片段与人类基因组的比率计算了FSR。结果显示，在5-Mb bins范围内共产生579个FSR特征；与HC相比，在ESCC中发现了83个FSR明显升高的bins，表明cfDNA片段发生了位置依赖性变化。在发现队列和外部验证队列中，与匹配HC相比，ESCC患者上述83个选定bins中的平均FSR明显更高；但癌前病变队列IEN患者中未观察到这现象。FSR在ESCC和IEN之间的不同表现表明，短cfDNA片段大小的比例与肿瘤进展之间存在潜在相关性。
图4：分析WGBS数据中的cfDNA片段大小。
为提高诊断能力，研究团队将遗传和表观遗传特征整合到了一个综合的EMMA模型中。特别地，50个最佳DMRs和153个CNV区域主要位于人类基因组的不同区域；74.54%最佳DMRs位于选定的83个FSR区域内；CNVs与FSR区域重叠也较少。对于153个区域的CNV和83个bin中FSRs特征，研究团队为每种模态创建了两个复合参数，并在发现队列中开发、验证了两个组合诊断模型：一个将50个DMRs与两个CNV参数结合（DMR+CNV模型）；另一个将50个DMRs与两个CNV参数和两个FSR参数结合（EMMA模型）。与ESCC-cfMeth评分相比，两个组合模型在10倍交叉验证、外部验证队列和癌前验证队列中表现出显著改善的性能。
为实现95%以上的特异性，研究团队选择了一个截断点用于EMMA模型。与ESCC-cfMeth评分相比，在外部验证队列中EMMA模型将灵敏度从70%提高到87%，在癌前验证队列中从50%提高到62%。总体而言，EMMA模型将IENs的检测率提高到62%，将I、II期的检测率分别提高到78%、83%，将III期的检测率提高到93%。
研究团队使用ESCC-cfMeth和EMMA对已发表的中国ESCC患者基线数据进行分析，来评估提高早期ESCC和癌前病变检测率的潜在益处。结果显示，当采用两种方法在患者IEN阶段进行早期检测和干预时，可提升中国ESCC患者的5年总体生存率：ESCC-cfMeth模型的5年总体生存率潜在增加范围为26.90%-35.25%；EMMA模型为 33.87%-41.95%。与仅利用cfDNA甲基化的ESCC-cfMeth模型相比，整合多模态数据的EMMA模型在假设临床情景中展示出更高的生存益处。综上，cfDNA甲基化标记在早期阶段和癌前病变中的表现优于CNV和片段化特征，多模态分析可以进一步提高其检测性能。
图5：三种cfDNA特征的互补性及组合模型的性能。
最后，研究团队评估了ESCC-cfMeth模型中50个DMRs在ESCC分子亚型中的价值，依据平均甲基化水平将ECGEA 队列中155名ESCC患者分成三组，即甲基化优势、适中和贫乏组。ESCC通常包括CCA、NRFA、IS和IM等四种亚型。结果显示，与甲基化适中、贫乏组相比，甲基化优势组中CCA亚型比例更高、IM亚型比例较低。接下来，研究团队研究了上述三组的TME成分，发现与其他两组相比，甲基化优势组中上皮细胞更多、免疫细胞更少。这些结果揭示了cfDNA甲基化标记物在ESCC分子亚型鉴定和指导治疗决策方面的潜在作用。
图6：ESCC cfDNA中DNA甲基化标记的生物学意义。
综上所述，研究团队开发了一种名为EMMA的综合分析方法，能同时识别差异甲基化区域（DMRs）、CNVs和片段化特征，以实现ESCC的超早期检测。该方法使人们能够分析cfDNA中ESCC的表观遗传和遗传特征的互补性、时间动态和检测效率，可确定最佳cfDNA甲基化特征的生物学相关性。该模型不仅显著提高了ESCC的无创检测能力，还具有动态分子监测和指导治疗潜在价值。
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