该研究中，研究人员采集了2576例cfDNA，其中包含来自2019年1月至2020年1月在8家参与医院就诊的1074名结直肠癌（CRC）患者、356名进展期腺瘤（ADA）患者，80名其它癌种（肝癌、胃癌、食管癌和肺癌）患者及1066名对照，对这些样本进行了全基因组5hmC水平的分析（实验设计如图1所示）。其中，来自上海及浙江地区四家医院的样本（含664例I至III期结直肠癌，144例四期或者分期不明结直肠癌，246例腺瘤，960例对照）作为训练及内部验证集，来自国内另外4家医院的样本（266例结直肠癌，110例腺瘤，106例对照）作为外部验证集。
图1 实验设计图
排除了年龄、性别因素的差异后，训练集中共得到1391个在I-III期结直肠癌/腺瘤和健康对照有显著差异（p<0.01）的基因区域，经过逻辑回归和弹性网络归一化处理之后，得到由96个基因组成的模型。由这些基因组成的模型可以较好地区分健康对照和肠癌I-III期及腺瘤患者，在训练集、内部验证集和外部验证集的曲线下面积（AUC）分别为94.6%，92.6%和87.2%（图2A），也能分别较好地区分健康对照和肠癌I-III期（图2B，AUC分别为95.6%，94.3%和90.7%），以及健康对照和腺瘤患者（图2C，AUC分别为91.8%，87.9%和78.6%），均高于单独使用这些基因的区分能力（AUC一般在52.0%到65.2%之间）。而且，从健康到腺瘤再到肠癌患者，基于5hmC基因模型的判分呈现出逐步升高的趋势，这在训练集、内部验证集和外部验证集中都表现得很明显（图2D）。
图2 由96个基因组成的模型可以较好地区分健康人和肠癌I-III期及腺瘤患者
与基于5hmC的基因模型相比，传统血清标志物CEA区分健康人和肠癌I-III期患者的能力明显稍逊一筹，其在训练集、内部验证集和外部验证集的AUC分别为78.0%，77.1%和73.2%（图3A）。基于5hmC的基因模型，无论是从AUC来看，还是根据90%特异性下的灵敏度来看，正确识别腺瘤和肠癌I-III期患者的能力都优于CEA（图3C, 3D）。尤其需要指出的是，基于5hmC的基因模型可以纠正单独使用CEA被错判的案例，如图3B所示，内部验证集中215例肠癌I-III期患者，其中145例（67.4%，图3B中第二、三象限）因为CEA值小于5ng/mL的标准阈值而被错判，但基于5hmC的基因模型能够正确判别其中的124例（57.7%，图3B中第二象限），因此大大提高检测的灵敏度。
图3 基于5hmc检测的预测模型表现好于传统血清标志物CEA
对1391个在I-III期结直肠癌/腺瘤和健康对照有显著差异的基因区域进行功能注释，发现其中富集了多个与癌症相关的KEGG代谢通路，例如神经活性配体-受体相互作用，钙离子、MAPK、cAMP信号通路等（图4A）。共修饰分析发现六组互作/共修饰模块（图4B），这些模块中涉及到的诸多基因和结直肠癌的发病机理和转移相关，例如模块M2中的GJA1基因（编码间隙连接蛋白α-1，图4C，4D）不但是得到的96基因模型之一，而且有文献报道表明和结直肠癌免疫浸润相关，是表征结直肠癌预后的生物标志物之一。
图4 差异基因的功能分析
同为无创检测，美国一项研究表明基于血液的检测，相比粪便检测更容易被人接受。而市面上多款仅限于Sept9基因甲基化的血清检测，其检出结直肠癌的灵敏度只有约48%，检出腺瘤的能力则更低，只有21%的灵敏度和79%的特异性。基于血液cfDNA进行全基因组5hmC水平检测，其检出结直肠癌和进展期腺瘤的灵敏度优于CEA等目前常用的各种标志物，而且由于其无创的特点，可以更加方便地加以推广，从而有助于在结直肠癌尚可通过手术切除的发展早期被及时发现，因此具有很好的研究和临床应该前景。
论文原文：
https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-24-0199
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