近期，美国孟菲斯圣犹大儿童研究医院的团队及合作者在Clinical Cancer Research发表了题为“SJPedPanel: A pan-cancer gene panel for childhood malignancies to enhance cancer monitoring and early detection”的文章。研究团队设计了一个针对儿童恶性肿瘤的泛癌基因panel——SJPedPanel，其包含5,275个编码外显子，297个用于检测融合/结构变异（SV）的内含子，以及7,590个用于检测拷贝数改变（CNV）的单核苷酸多态性位点（SNP）。

利用实时临床基因组学（RTCG）队列，研究团队验证了SJPedPanel对儿童癌症相关基因的优越覆盖范围和性能。在RTCG队列报告的485个致病变异中，SJPedPanel覆盖了86%的变异，包括82%导致融合癌蛋白的重排（共90个）；在靶向重测序队列中，SJPedPanel检测到91%致病变异（共389个）。等位基因频率（VAF）为0.5%时，该基因panel能够检测到约95%的变异，VAF为0.2%时，检测率约为80%。此外，SJPedPanel还从形态学白血病缓解样本中检测到低频驱动突变，从监测样本中检测到复发富集突变，展示了其在癌症监测和早期检测方面的潜力。

研究团队通过整合44项已发表的儿童癌症肿瘤-正常配对基因组学研究结果设计了SJPedPanel（图1），涉及白血病、脑瘤和不同实体瘤。

SJPedPanel包括来自5,275个编码外显子的106.9万个外显子碱基对，用于检测357个已知儿童癌症驱动基因的蛋白质编码突变；94个基因297个内含子的143.8万个碱基对，以检测导致亚型定义致癌融合的SV；来自启动子区域的20.9万个碱基对用于检测启动子改变；对于高度复发的致癌基因（MYCN）和抑癌基因（CDKN2A、PAX5和SMARCB1），使用探针覆盖整个基因区域以检测CNV。总体而言，研究团队设计了282万个碱基对，以检测潜在的单核苷酸变异（SNV）、插入或缺失（Indel）、SV、CNV和杂合性缺失（LOH）驱动基因改变。

此外，研究团队还选择7,590个SNP检测整个基因组的CNV/LOH，这些SNP共占据了约189.75万个碱基对。综上，SJPedPane由约470万个碱基对组成，约占人类基因组的0.15%，能够在每个样本标准WGS（30X）的等效测序量下达到30000X，从而实现具有成本效益的癌症监测和/或早期检测。

图1. 儿童癌症基因panel的设计。

研究团队比较了SJPedPanel和其他六种常用的儿童癌症商业化DNA panel的基因含量（图2），包括FoundationOne Heme、FoundationOne CDx、MSK-IMPACT、OncoKids、CHOP CHMP/CSTP和Oncomine Comprehensive assay v3（OCAv3）；并使用两项涉及2,578例患者的儿童泛癌研究中报告的183个驱动基因列表进行评估。

结果显示，SJPedPanel覆盖了159个（87%）基因，其他panel覆盖的基因<60%。特别地，与其他panel相比，SJPedPanel独特覆盖了105个基因，如Wilms肿瘤的DGCR8和SIX1、急性髓系白血病和急性淋巴细胞白血病（AML/ALL）的UBTF和PICALM等。在所有panel中，SJPedPanel覆盖的内含子区域最大，这些区域与导致融合癌蛋白的重排密切相关。

除与上述panel的比较外，研究团队还将SJPedPanel的基因含量与公开的癌症基因列表（OncoKB数据库）进行了比较。结果显示，SJPedPanel中的67个基因在OncoKB中缺失，其中包括24个已知的驱动基因，以及其他独有基因如UBTF等。总之，SJPedPanel为儿童恶性肿瘤相关研究提供了迄今为止最全面和最新的基因改变覆盖范围。

图2. SJPedPanel与其他panel的基因比较。

基因组测序（尤其是panel测序）的一个关键考虑因素是覆盖均一性。为此，研究团队对使用COLO829BL（ATCC#CRL-1980）制备的四个靶向测序文库（C1-C4）进行了测序，分析了SJPedPanel在碱基对水平和区域水平的捕获均一性。COLO829BL是一种非癌细胞系，广泛用于临床性能测试或基准测试。结果显示，SJPedPanel的捕获效率优异，且在不同的测序平台上具有可重复性。

图3. panel每个碱基和每个区域的捕获均一性。

已发表的"Genome for Kids"（G4K）研究使用WGS、WES和RNAseq对来自RTCG队列253个儿童病例的致病性和可能致病性（P/LP）变异（以下称为驱动变异）进行分析。最终共检测出485个驱动变异，包括SNV、Indel、SV、Fusion/SV（导致融合蛋白的结构重排）和内部串联重复（ITD）

接下来，研究团队比较了SJPedPanel和WES对上述已报道的儿童癌症改变的覆盖率，并对其靶向的区域进行计算机模拟分析（图4）。结果显示，SJPedPanel覆盖了86%的驱动变异，WES覆盖了76%。进一步分析表明，WES覆盖了12%断点位于外显子区域的Fusion/SV，SJPedPanel覆盖了82%该类事件；SJPedPanel覆盖了100%的ITD，WES未覆盖13%的ITD。

为验证上述计算机模拟结果，研究团队使用SJPedPanel对RTCG队列中113例病例进行了靶向重测序，这些病例共包含389个驱动变异。结果显示，SJPedPanel覆盖了91%的驱动变异。此外，在通过三种测序方法发现的205个SNV、Indel、SV和ITD变异中，SJPedPanel 覆盖了这些变异的88%，WES覆盖了78%。这些数据进一步证实了将SJPedPanel应用于儿童癌症的优越性能，该panel大小仅为WES的10%。

图4. SJPedPanel的诊断率。

panel测序的重要应用之一是疾病监测，在这种情况下肿瘤负荷通常小于1%，因此变异罕见且难以检测。为研究SJPedPanel的适用性，研究团队对6种儿童癌症细胞系和1种非癌症细胞系进行稀释实验，6种癌症细胞系共包含26个独特的P/LP变异。当稀释浓度高于0.5%时，SJPedPanel实现了>90%的检测率，检测率随着稀释浓度降低而迅速下降。

为进一步研究测序深度对检测率的影响，研究团队进行了计算机模拟的降采样实验。对于稀释浓度≥1%的样本，深度的下降不影响召回率，其仍接近100%；对于稀释浓度<1%的样本，召回率随降采样深度下降；对于稀释浓度为0.5%的样本，召回率从3000×时的97%下降到1000X的75%。因此，VAF为0.5%的标记可在2500×~3000×深度下被可靠检测。这一结果表明，目前的检测限（LoD）在0.1%至0.5%之间，

上述捕获效率和稀释实验数据共同揭示了为达到所需检测能力如何设计测序深度提供了见解：在预先确定的0.5% VAF灵敏度水平下，需要2100X深度才能确保95%的召回率。因此，应将SJPedPanel的平均深度定为3×2100 (= 6300×)，以确保95%的目标区域达到> 2100×深度。由于SJPedPanel的总空间约为人类基因组的0.15%，6300×相当于9x覆盖率的WGS。

图5. SJPedPanel超灵敏检测。

综上所述，研究团队开发了基于杂交捕获的检测SJPedPanel，共靶向357个儿童癌症相关基因。与其他常用的panel相比，SJPedPanel具有独特的覆盖范围，涵盖了儿童癌症中经常涉及的105个基因。随着技术的进步和儿科癌症研究的不断深入，SJPedPanel有望显著改善儿童癌症患者的管理和诊断。